2016年的27个热质粒

每季度，我们通过我们突出了存储库中的新质粒的子集热质粒的文章．这些简短的文章突出了分粒细胞或一组质粒的主要特征和应用。我们希望这些文章能够更轻松地找到和使用所需的质粒。您可以从下面的2016年找到所有热质粒。含有超过45,000个质粒，我们不能为储存库中的每种伟大质粒写帖子，但务必如果你想写信，请告诉我们关于你的质粒的博文。没时间看书?听着我们的热质粒段在加入播客。

把质粒:

3月（Q1）|6月(Q2)|2016年9月（Q3）|2016年12月(第三季)

虽然已经开发了许多技术来研究增强剂的功能、强度和结合(例如:DHS-seq，Faire-SEQ.， 和芯片SEQ.)，由于增强子序列在不同染色质状态的可用性不同，全基因组的识别和量化增强子活性仍然具有挑战性。亚历山大·斯塔克分子病理学研究所的同事们开发了一种替代方法，被称为STARR-seq(自转录活性调节区域测序)，它在内源性染色质环境之外测试增强子序列，依赖于增强子的功能独立于其相对于转录起始位点的位置。在STARR-seq中，随机剪切的基因组文库被克隆到最小启动子序列的下游。如果这些随机的DNA片段中有一个包含增强子，它将从最小启动子激活自己的转录，其强度可以通过使用下一代测序从其在输入水平上的富集来确定。STARR-seq主干可以从Addgene中获得人类和飞版本。

• 阿诺德等人。科学》2013。PubMedPMID：23328393

吴实验室人类慢病毒CRISPR文库

CRISPR汇总图书馆使研究人员能够筛选整个基因组中调控各种表型的基因，包括但不限于细胞生长和耐药性。最近,吴实验室德克萨斯理工大学开发了一个聚合CRISPR敲除文库，并使用该文库筛选与西尼罗河病毒(WNV)诱导细胞死亡有关的基因。

Wu实验室文库由77406个个体grna组成，共针对人类基因组中的20121个基因(可以找到基因和目标序列的一致性)在这里)．为了使用该库，作者将其包装到慢病毒中，并利用由此产生的慢病毒库生成一个表达针对单个基因的单一gRNA的HEK293FT细胞群。然后用表达cas9的质粒转染gRNA表达细胞，生成突变细胞群体。以足以杀死所有对照细胞的剂量和持续时间对突变细胞进行处理，并对幸存的“突变”菌落进行深度测序，以识别保护WNV的gRNAs。通过这种筛选，作者能够鉴定出7个以前未被怀疑的基因，它们在er相关降解(ERAD)中发挥已知的作用，正调控WNV诱导细胞死亡的能力(SEL1L, UBE2J1, EMC3, EMC2, DERL2, UBE2G2和HRD1)。

吴实验室敲除库是可用的随着越来越多的CRISPR图书馆从Addgene的存储库中提取，可以用于对人类细胞进行筛选。关于如何使用CRISPR集合库以及良好筛选实验的标准的一般信息可以在我们的博客文章中找到“利用CRISPR/Cas9进行全基因组筛选”．有关WU实验室库的详细信息可以在其中找到相关的出版物．

• 妈,等。2015细胞众议员。PubMedPMID: 26190106

PRESTO-TANGO:药物发现的开源资源

近三分之一的所有药物靶G蛋白偶联受体（GPCR）然而，人类基因组中的三分之一的GPCR是孤儿受体，其意味着它们的配体是未知的。鉴定孤儿GPCR的新配体具有显着的医学兴趣，然而，缺乏缺乏工具，化合物和测定来阻碍缺乏的工具，化合物和测定来阻碍这些受体的激活。布莱恩罗斯的实验室有一个新可用的PRESTO-TANGO工具包这使得研究人员使用快速，负担得起和无处不在的记者测定来询问可用于毒性人GPCR-OME。在他们最近的出版物中，Kroeze等人．描述他们的增强探戈诱导募集测定掺入314个密码子优化的人体细胞系表达的GPCR序列。在古典探戈测定的扭曲中，Kroeze等人。通过转录输出 - 探戈开发了一种具有平行受体 - OME表达和筛选的新方法（Presto-Tango.)针对整个试剂盒筛选NCC-1批准药物库;一项平行分析，成功识别出新的、高度特异性的孤儿GPCRs激动剂，证明了该平台在药物发现中的实用性。研究人员可以直接使用PRESTO-TANGO试剂盒中的质粒进行药物筛选，或者轻松地将经过优化、表达验证的GPCR序列传输到任何所需的主干。

• Kroeze, et al。国家自然科学基金，2015。PubMedPMID：25895059.
• 巴尼亚,et al。美国国立科学学院学报2008。PubMedPMID：18165312

CIDAR MoClo部件套件

合成生物学家和基础生物学家通常都需要测试多种表达系统，才能达到他们感兴趣的基因的适当表达水平。尽管涉及改变基因表达的部分是众所周知的，特别是在细菌中，克隆、结合和测试这些不同部分的过程可能是相当艰巨的。仅克隆过程就涉及大量的文献检索、DNA合成和质粒组装。幸运的是,研究人员道格拉斯Densmore的实验室波士顿大学极大地简化了生成倍数的过程大肠杆菌基因表达质粒与设计自动化研究实验室Moduclar克隆的跨学科整合（CIDAR MoClo)部分设备。

该试剂盒由多种质粒组成，质粒包含许多不同的启动子、RBS '、编码序列(CDS)和不同强度的终止子。这些可以很容易地与你感兴趣的基因结合，并使用低成本的一罐法克隆到提供的目标载体中金门克隆这导致了许多的创造大肠杆菌具有不同表达水平的构念。CIDAR MoClo Parts Kit中的93个质粒可作为甘油储存在单个板中，每个质粒或作为单个质粒作为琼脂刺运输。

• 艾弗森,et al。ACS Synth Bio. 2015。PubMedPMID：26479688．

RAS途径克隆收集2.0

Ras蛋白是一种小型GTPases，参与细胞信号通路，控制许多细胞过程，如分化、增殖和凋亡。在人类中，三分之一的癌症中发现了永久激活Ras基因的突变，包括高百分比(高达95%)的胰腺癌。Ras致癌基因在治疗上很难靶向，这在很大程度上是由于Ras蛋白在细胞信号转导中发挥的核心作用。了解Ras信号通路中的分子如何相互作用将使科学家开发出更好的抗癌策略。为了促进创新的癌症研究，NCI的参考试剂组RAS倡议为首的Dominic Esposito.最近，该公司向科学界发布了一组360 Ras通路质粒。

这个集合由来自RAS信号通路的人群型谱的基因的质粒组成，包括180个独特的转录物。选择每个基因以表示38种人癌中的主要剪接变体。许多现有源无法从其他现有来源获得，并且在打开（无停靠密码子）中提供并关闭（包括终止密码子）格式。该集合与标准网关克隆和兼容FNLCR组合克隆平台(CCP)；后者极大地提高了该集合的实用性，因为它可以方便地创建与表位或荧光团融合的蛋白表达结构，生成具有各种适合于体内表达的启动子的表达载体，以及/或生成用于突变细胞系或转基因动物的载体。

• 墙壁等人。方法mol Biol。2014. PUBMED.PMID: 24395366

牛津果蝇Crispr.1图书馆

Addgene拥有分销的特权几个人类和鼠克里普普尔汇集了图书馆，但多亏了实验室的沉淀物刘建博士在牛津大学，我们现在提供强大的基于CRISPR的筛选来源果蝇社区。集合库，设计用于培养果蝇细胞，靶向13,501个与至少三个独立的GRNA的飞基因，每个GRNA策略性地选择，以最大化通过架构产生功能敲除的可能性，并最大限度地减少偏离目标效果。图书馆被克隆到刘实验室自己pAc-sgRNA-Cas9昆虫表达骨干，从a表达grna果蝇U6：2启动子和Cas9来自actin 5c启动子。加入飞图书馆网页提供了更多的细节和协议，刘实验室的OXfCRISPR页面为希望利用这一强大的基因组工程工具的果蝇实验室提供了许多其他有用的资源。

• 巴,et al。中国基因工程杂志。2015。PubMedPMID: 26165496

GMAP -一个新的组装平台，生成简单和复杂的DNA结构

你是否曾经希望你能设计一个基因敲除或过表达实验，生成必要的结构，并在短短3天内完成筛选?多亏了Tyler Jacks的实验室，这个3天的目标现在可以实现了。的杰克实验室最近推出了一个名为GMAP的新装配克隆平台（基于Gibson组装的模块化装配平台）。GMAP基于吉布森大会该方法利用序列的同源性区域(通常为30-40bp重叠)，可以方便地组装DNA片段。为了扩展Gibson组装的能力，并打造一个更模块化的平台，Jacks实验室生成了5个常见的30bp重叠序列(Sites #1-5)。每个重叠位点编码一个独特的限制性内切酶位点和独特的引物位点，分别通过限制性内切酶和Sanger测序进行快速筛选。GMAP的速度和简单性使科学家能够轻松地设计、生成和测试由复杂遗传元素组成的结构。

为了展示垃圾的有用性，杰克斯实验室为各种各样的生物应用构建了几个GMAP兼容的载体。首先，Lentivirus的GMAP兼容骨架LV 1 - 5和逆转录病毒RV 2-5被建成了。然后，作者使用GMAP组件来建立超过30个启动子和140个基因的集合，包括具有独特的组织特异性启动子，表达GFP，四环素反应元件和SHRNA的组织特异性启动子可以在Addgene．由于GMAP装配利用了5个不同的重叠位点，这项技术也允许简单和快速地将复杂元件定位到特定的基因组位点。例如，作者生成了一个gmap兼容的主干，包含Rosa26同源臂。Rosa26位点通常用于驱动小鼠中靶基因的普遍表达。Jacks实验室利用这个主干将cag驱动的loxP-stop-loxP盒定位到Rosa26位点，允许GMAP插入基因的crea依赖表达。这种模块化系统的应用是无止境的，随着科学家们使用GMAP，可用于社区的兼容骨干、启动子和基因将会不断扩展。如果你计划在实验中使用GMAP，请考虑使用Addgene来沉积你的新质粒，以帮助扩大收集!

杰克实验室已经为科学界提供了几种GMAP兼容质粒通过Addgene．

• Akama-garren等人。j遗传学基因组学。2016. PUBMED.PMID: 26887506

多伦多KnockOut (TKO) CRISPR库

为了确定核心和上下文依赖的人体健身基因，杰森·莫法特的实验室多伦多大学的研究人员创造了多伦多KnockOut (TKO) CRISPR文库．这个复杂的第二代CRISPR慢病毒库以几乎所有的人类蛋白编码基因为目标，它的独特之处在于它由两个子库组成。第一个是碱基“90k文库”，包含约90000个grna，靶向约15000个基因，每个基因6个grna。第二种是一个“补充”库，每个基因包含额外的6个gRNA，使用稍微放松的gRNA设计参数生成。

为了证明其文库设计的有效性，莫法特实验室成员在不同的人类细胞模型中进行了多次筛选，并发现了约4-5倍于以往此类筛选的适应度相关基因。他们还能从功能上描述正面撞击。这项工作在牢房发表．

莫法特实验室有网站用于包含最新信息和数据集的TKO库，以及交互式gRNA查看器．莫法特实验室也储存了Cas9和gRNA骨干质粒Addgene。用于TKO库的额外控制质粒将很快在Addgene提供。

• 哈特,et al。细胞。2015。PubMedPMID: 26627737

pORTMAGE:跨平台细菌基因组工程的便携式方法

最近在基因组工程和合成生物学领域的发现改变了科学家在细菌中创造新的特征，并使得对许多生物过程进行了深入研究。虽然这些方法可用于容易修改基因组内的个体基因座，但它们倾向于在同时修改多个基因座（多路复用）时显示它们的限制。

目前，唯一能够快速，自动化和高通量基因组编辑的细菌中唯一的基因组工程方法是多路复用自动化基因组工程（法师）（1)．法师使用重组(2）为了同时掺入多链DNA（SSDNA）寡核苷酸（寡核苷酸），从而快速培养所需的等位基因组合和组合基因组文库。法师允许基因组 - 工程努力在无与伦比的复杂性中大肠杆菌，比如构建所谓的“基因组编码生物体”(3.)，但它对其他菌株的可移植性仍然受到严重限制，因为每个目标物种都需要事先进行优化。事实上，为了使用MAGE，需要在宿主菌株中表达λ Red重组酶，并抑制固有甲基定向错配修复(MMR)系统。

为了解决这个问题，Csaba朋友的实验室已经创造了一组载体，允许在未改良的细菌物种中使用MAGE方法(4)．这套质粒(被称为pORTMAGE）表达λ红重组酶，以及优势阴性突变等位基因大肠杆菌MMR蛋白MutL，均受cI857温度敏感阻遏因子控制。MutL突变体的温控表达能够在寡核苷酸整合过程中瞬间抑制DNA修复，使MAGE在其他未修饰的菌株中(5)．Mutl在遥远的亲戚中受到高度保守的大肠杆菌所以它可以被广泛使用。因此，pORTMAGE同时允许在几个生物技术和临床相关的细菌物种中进行基因组编辑和突变文库生成。

pORTMAGE载体为在广泛的细菌宿主中修饰基因组开辟了新的领域。这个神奇的工具现在可以在Addgene上使用，所以你可以成为“法师”，在细菌中创造新的性状。

1. 王等。自然》2009。PubMedPMID: 19633652

2. 法院,et al。Annu Rev Genet, 2002。PubMedPMID: 12429697

3. Lajoie, et al。科学》2013。PubMedPMID: 24136966

4. Nyerges, et al。美国国家科学院学报。2016. PUBMED.PMID: 26884157

5. Aronshtam, et al。核酸Res. 1996。PubMedPMID：8692687

用ph敏感的荧光生物传感器Rosella跟踪酵母中的自噬

一种ph敏感的荧光生物传感器为基础的检测系统最近沉积与AddgeneMark Prescott博士．Prescott博士和Rod Devenish博士（蒙纳士大学）最初开发了用于监测和分析酵母细胞中细胞溶胶和细胞器的自噬的系统。以鲜艳的澳大利亚鹦鹉，双色发射生物传感器命名罗萨斯该生物传感器的关键在于pH值:DsRed相对不敏感，而SEP在细胞pH值(7.0)时发出荧光，而在液泡pH值(6.2)时则不发出荧光。罗塞拉因此随细胞的颜色位置:它是红色和绿色的细胞,但变成更多的红色在低pH值(如空泡的)环境中灭活9月,只留下安全域(1)的萤光。与变异,可以针对特定的细胞隔间(Cytosol，addgene目录＃71245；线粒体，addgene目录＃71247) Rosella提供了一种简单的方法来跟踪细胞物质进入酵母液泡的摄取，以及检查自噬途径背后的机制。

• Rosado, et al。自噬》2008。PubMedPMID：18094608

重新调整靶向DNA甲基化的CRISPR-CAS9系统

研究表观遗传修饰的传统方法是使用DNA甲基转移酶或组蛋白去乙酰化酶等表观遗传修饰酶的抑制剂。不幸的是，这些抑制剂通常是非选择性的，影响整个基因组而不是特定的位点。为了克服这一缺陷Zoldos.该实验室开发了用于表观基因组编辑的CRISPR工具，能够精确研究特定的表观遗传修饰及其对基因调控的影响。

Zoldos教授和来自生物部的同事，分子生物学分工萨格勒布大学，通过将催化域（DCAS9）与来自DNA甲基转移酶DNMT3A的催化结构域融合，构建了基于CAS9的基于CAM9的工具，用于靶向CPG甲基化。合作表达修改Cas9与靶向特定基因组座位的GRNA一起导致遗迹甲基化。这种强大的工具已用于将甲基化与IL6ST和BACH2启动子的甲基化和降低。

• Vojta A等。诊断。酸> 2016。PubMedPMID: 26969735

更新的生物素化工具，以识别近似的蛋白质

的Roux实验室沉积了小版本鉴定蛋白质蛋白缔合法的流行生物素化方法中使用的混杂生物素连接酶的影响。该方法使用与生物素连接酶融合的诱饵蛋白，以在细胞中的生物素酸近似蛋白质。这些候选蛋白可以通过生物素下拉方法来富集并使用质谱法鉴定。

Roux实验室的BioID的新改进版本，称为BioID2，明显更小，允许更有选择性地靶向融合蛋白，需要更少的生物素，并显示了增强的近似蛋白标记。总体而言，BioID2提高了筛选蛋白质-蛋白质相互作用的效率。

鲁克斯实验室已经有了HA标记Bioid2.对于n末端融合和Myc标记BioID2c端融合。

• 金等。生物医学杂志。2016。PubMedPMID：26912792

FusX-TALEN装配系统

作为核酸酶的TALEs (TALENs)是两种基因编辑工具在体外细胞系统和多样的模式生物。Addgene最新的TALEN试剂盒FusX装配系统从斯蒂芬ekker实验室，是改良版的金门TALEN KIT（GGT）简化了故事的组装重复进入单管，3天过程，通过预先组装的三聚片来减少克隆步骤的数量。FUSX系统在斑马鱼中验证，并显示出在基因组靶向设计灵活性方面提供高活动和无与伦比的特异性。Fusx套件向后兼容，与先前为金门Talen和TAL效应套件2.0构建的所有TAL效应支架兼容。

妈,等。2015。PubMedPMID：26854857

addgene可用的FUSX兼容目标向量的示例：

Superglue蛋白与SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher

重组DNA技术的发展使分子生物学家能够以期望的顺序将DNA片段融合在一起，并在靶细胞中表达融合蛋白。除了基于核苷酸的连接策略外，当单个蛋白表达是首选或必需的，或者当细胞因其长度而难以合成或折叠蛋白质时，翻译后蛋白融合将是有利的。马克霍沃斯的实验室最近设计了一种新的肽/蛋白质对，SnoopTag / SnoopCatcher它可以通过自发的异肽键将所需的蛋白质不可逆地连接在一起。当与之前描述的SpyTag/SpyCatcher对结合使用时，通过交替使用SnoopTag/SnoopCatcher和SpyTag/SpyCatcher对，可以在迭代过程中合成多种蛋白融合。

为了提高组装这些多蛋白融合或“Polyproteams”的缓解和便利，罗拉明实验室创造了MBPx-SpyCatcher构造．该构建体用于产生麦芽糖结合蛋白/截止蛋白融合，其可以通过Spytag / Spycatcher和SnoOptag / Snoopcatcher键锚定用于通过SpyTag / Spycatcher和Snooptag / Snoopcatcher键的固相合成的固态合成。一旦制备了所有所需的顺序添加，可以使用麦芽糖洗脱最终的聚丙胺。该方法允许稳定和定向的蛋白质融合，其留在每种蛋白质单元之间存在的间距和侦听器连接器，并提供一种用于产生蛋白质链或簇的新方法。

Veggiani, et al。美国国立科学院科学研究所2016。PubMedPMID: 26787909

EasyClone 2.0酵母工具包

许多行业，如食品和饮料行业、生物乙醇行业和制药行业，都依赖酵母，酿酒酵母作为生产其产品的主要宿主，包括发酵啤酒和葡萄酒，燃料，药物成分和重组蛋白。为了保持产量高，成本低，并处理越来越多的新化合物，需要工业酵母菌株的遗传优化。然而，由于它们是原型的，因此产业酵母菌菌株比常见的实验室酵母菌菌株更难以遗传修饰，因为它们是原型的，通常具有低水平的同源重组，并且可能难以转化。

增加工业酵母菌株的遗传工具箱，Borodina实验室最近设计了EasyClone 2.0工具包．EasyClone 2.0由25种含有长同源性臂和滋巢营养和主导选择标记的综合载体组成，允许与实验室和原型菌株一起使用。该载体基于原始EasyClone载体（Jensen等人，2013年)允许克隆多达两个基因与双向启动子，整合在11个特定的染色体位置，并稳定地表达整合基因。这些载体包含基于尿嘧啶切除的(用户）位于ADH1和CYC终止子的位点，以便于基因和启动子克隆。除用户克隆外，此工具包还与诸如融合等系统兼容，吉布森， 和MoClo．EasyClone 2.0套件已通过Addgene公开可用。

• Stovicek, et al。微生物与生物技术。2015。PubMedPMID: 26376869
• 詹森,et al。FEMS酵母研究，2014。PubMedPMID：24151867
• 麦克尔森,et al。金属底座Eng。2012。PubMedPMID: 2232647

SAPTRAP，一种用于高吞吐量CRISPR / CAS9基因修改的工具包Caenorhabditis elegans.

CRISPR / Cas9t由于其简单，易于修改的RNA引导的靶向机制，Echnology已经在多种生物体中彻底改变了基因组编辑。然而，修复模板的艰苦建设和指导RNA构建体以及鉴定正确改性的生物所需的困难屏幕具有有限的常规使用该技术。简化基于CRISPR / CAS9的基于遗传标签插入C. Elegans.基因组,erik jorgensen的实验室从犹他大学发展起来SapTrap．

SapTrap系统使用金门组装以产生单个质粒靶向载体，该载体既编码引导RNA转录本，又编码单个标记事件的修复模板。通常使用的序列，包括荧光标签，一个环状的Cbr-unc-119选择标记，以及连接标签到目标基因的“连接器”，从预先构建的供体质粒库提供反应，可从addgene.．同源臂和引导RNA的位点特异性序列是作为退火合成寡聚体提供的，无需在质粒组装过程中进行PCR或额外的分子克隆步骤。

此工具包降低了生产用于在蠕虫中编辑的基因组编辑的vorpors所需的费用和工作负载，以便可以执行高吞吐量标记项目。

施瓦兹,et al。遗传学》2016。PubMedPMID：26837755.