解决病毒转导问题的5个技巧

一个估计有32万种病毒可以感染哺乳动物．更丰富的是地球上的估计10³¹噬菌体(感染细菌的病毒)，其中许多在我们的微生物群中起着重要的作用。考虑到病毒无处不在，无所不能，当我们试图在实验中使用它们，但它们却什么都不做时，这可能会令人恼火。

病毒是复杂的，它们执行复杂的生物任务，这两方面都是它们可能带来的技术挑战的因素。许多研究人员发现他们自己在某一点或另一点被排除基于病毒的实验所困扰。在扩增病毒载体、收集病毒、转导靶细胞之后，人们可能会有不幸的经历，看到……什么都没有。由于某些不清楚的原因，细胞没有被转导。在这里，我将分享五个“万福玛利亚”，它们在处理病毒时帮助我排除了一些技术障碍:

1.188完整比分直播病毒载体经历DNA重排。

根据病毒载体的组成和LTR中存在的重复序列，载体在复制过程中可能会发生基因组重排。为了避免基因组重排，尝试用细菌放大病毒载体，以减少重排，例如内稳定或者使用标准菌株，如DH5α，生长在30°C而不是37°C。如果您不确定您的病毒的完整性，执行诊断限制性内切酶消化和一些可靠的对照。

2.病毒库存可能对冻融循环很敏感。

根据研究人员和病毒类型的不同，每次冻融循环滴度损失的报告从5%到50%不等(Krajdenet al。, 1999年；Ugaiet al。, 2002年）.如果病毒将在几天后使用，一些研究人员更喜欢在4°C保存新收获的病毒，而不是在-80°C短暂保存。如果进行故障排除，最安全的选择可能是避免完全冻结，而是在收获后立即使用病毒。有趣的是，在宿主细胞转导之前立即进行冻融处理已被证明可将AAV转导效率提高约15倍(陈et al。, 2006年）.

3.转导效率取决于病毒滴度

这两种情况都可以通过集中病毒库存来增加。不同浓度测定方法可以揭示物理效价和功能效价的差异。如果你有低滴度(这是不可避免的一些载体)，你可以浓缩你的病毒的病毒库存超离心法，然后在一个较小的体积重悬收集的颗粒。在进行超离心之前，一定要清除包装细胞碎片，以避免包装细胞污染您的转导。包装细胞碎片可以删除病毒通过过滤解决方案(通过0.45µm或0.22µm过滤器)或离心步骤(5分钟在300 - 500克)。去除包装细胞碎片后,病毒可以通过超速离心法颗粒状(75000 - 225000 g为1.5 - 4小时4°C)。超离心后，病毒可呈白色小球出现。然后将颗粒漂洗并在冷的无菌PBS中重悬。

或者，在不进行超离心的情况下浓缩病毒溶液，可以在转染后立即减少包装细胞上的细胞培养基的体积。换句话说，在转染细胞后更换培养基时，用通常使用的一半体积替换培养基(例如，在10cm板上使用5ml培养基)。通过减少释放病毒的培养体积，可以得到更浓缩的病毒溶液。

4.加强virus-cell联系

多种试剂可提高转导效率。这些试剂通常通过减少这两个带负电荷的薄膜之间的斥力(戴维斯et al。, 2002年）.聚苯是一种常用的阳离子试剂，已被证明可将转导效率提高10倍(戴维斯et al。, 2002年）.然而，聚苯乙烯对冻融循环高度敏感，应一次性储存。不要使用多次解冻的聚苯乙烯溶液。纤维连接蛋白是另一种膜相互作用蛋白，可用于提高对聚苯乙烯毒性敏感的细胞(如造血细胞或原代细胞)的转导效率，并已被证明可将转导效率提高1.5倍(Stockschladeret al。, 1999年）.

5.检查包装细胞是否感染

如果你的转导不起作用，你可以检查是否有病毒产生通过转染过的包装细胞。这种检查可以在不中断实验流程的情况下进行。如果你的包装细胞已经被成功转染并产生了传染性病毒，它们可能会被这种病毒感染，因此，将会被编码在病毒载体中的耐药基因的抗生素选择。这种抗生素选择可以在转染约72小时后进行，在1-3天的选择后，包装细胞的存活率约为20-50%。较低的存活细胞百分比可能是转染过程中重组质粒整合的结果，并不一定表明病毒的产生。或者，如果病毒编码a荧光protein在美国，包装细胞可以用显微镜检查，如果它们被感染，应该出现荧光。虽然转染后可能有一些低水平的荧光蛋白或抗性标记物表达，但大约72小时后的高水平表达可能是成功的病毒转导的结果。如果病毒没有适当的嗜性来感染包装细胞，这种方法可能不起作用。确保病毒产生的另一种方法是使用收集的病毒溶液作为PCR模板对病毒载体的组分进行PCR。

不管你研究的是哪种病毒，在病毒的设计、生产和转导过程中都有很多工作要做。一旦你收获了，通常最好是效价你的病毒．获得给定病毒库存中感染性颗粒的准确数量将使您对病毒库存的感染性有一个认识，节省您的时间，并允许您稍后标准化您的实验。请继续关注Addgene博客，一定要188博金宝官网查看我们的病毒载体指南页面来获取最新的病毒实验技巧

参考文献

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4.Mel Krajden等。用分支DNA技术测定多次冻融循环对乙型肝炎病毒DNA和丙型肝炎病毒RNA定量的影响临床微生物学杂志37.6(1999): 1683 - 1686。PubMedPMID: 10325307．公共医学中心PMCID: PMC84922．

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