分析和排除Sanger测序结果的6个技巧

本博客最初发表于BitesizeBio这里．

作为我工作的一部分，确保质量质量addgene.在美国，我每周分析50-100例测序反应。所以我已经养成了一些好习惯，我想把这些好习惯传递给你们，以确保你们能最大限度地利用从测序中得到的数据。

当你在凝胶上进行限制性消化时，你总是包括适当的控制，如未切割的DNA和适当的梯子。这些控件可以帮助您正确地可视化您的结果。其中最重要的是始终仔细查看从您最喜欢的测序设备获得的测序结果的跟踪文件(或色谱图)。

当涉及到DNA测序时，色谱图是你的视觉控制。而且，就像所有的控制一样，错过是一个很大的错误。

色谱图可以帮助分析和解决DNA测序结果的问题

上面(这篇文章的右上角)是一个看起来干净的DNA序列(没有Ns在视线中)的例子。如果你从未看过痕迹你就会幸福。

但看起来更近，色谱图中的重叠峰表明结果不像序列所暗示的那样确定。事实上，这是如此模糊的是，应该重复DNA测序反应。

帮助进行DNA测序、故障排除和分析的指南

1.您可以使用下列任何程序来查看。ab1色谱文件

• 4Peaks.(Mac)
• SnapGene查看器（Mac / PC）
• FinchTV（Mac / PC）
• 顺序扫描(PC)
• 浓度(PC)

2.你应该看到一个个的、尖锐的、间隔均匀的峰

这样的……

3.预计能得到500-700个干净可靠的DNA序列

否则，你可能会怀疑你的样本受到了污染，或者考虑要求你的测序设备为一个困难的模板应用一个特殊的方案。再多的话，你就是在冒险进入不确定的领域。

4.永远不要相信DNA测序的前20-30个基础阅读

这里的峰通常是未解决的和小的，所以我建议设计你的引物至少在感兴趣的序列上游50bp。

5.使用二氧化硅旋转柱纯化你送去做DNA测序的样品

如果您的测序设备要求您进行自己的大染料PCR扩增反应(而不是使用一些公司提供的全面服务)，您可以通过醋酸钠/异丙醇沉淀法或使用几个供应商提供的二氧化硅旋转柱来纯化产品。沉淀法有一个不幸的副作用，就是会扰乱70-75碱基的反应(见下图)，所以我强烈推荐使用硅柱。它们可能很贵，但非常值得。