基于crispr的大肠杆菌基因组编辑系统

最初发布于2021年4月13日，最后更新于2021年8月12日。

这篇文章是由客座博主、杨实验室博士研究生张奕文、四川师范大学讲师李琪、杨实验室实习生张杰泽和中国科学院合成生物学教授杨盛共同撰写的。

在Yang实验室，我们不断优化细菌CRISPR编辑系统的使用。我们的pCas / pTargetF系统已经成为最流行的基因组编辑系统之一E.．杆菌．但是，有些用户指出这个系统无法正常运行E.．杆菌BL21（DE3）作为转化体在PTargetF转换到BL21（DE3）/ PCAS应变之后未能生长。作为响应，我们修改了PCAS / PTargetf系统并将其更新为pEcCas / pEcgRNA系统．该系统适用于工程单个基因组编辑，但是它引入的双层断裂使得难以在基因组上执行两个或更多个集成。最近，我们开发了一种新的系统“使用CRISPR相关转移酶的多拷贝染色体集成”或MUCICAT。

在这里，我们将描述每一个CRISPR系统。

原pCas/pTargetF系统

我们的原始PCAS / PTargetf系统由一个表达的质粒组成S.．pyogenes.Cas9，一种用于自我固化的温度敏感的复制品，一种阿拉伯糖诱导lambda-red.iptg诱导的sgRNA序列靶向pTargetF上的pMB1复制子（江等人。，2015）．除PMB1复制品外，PTargetf还包含针对感兴趣的基因组位点的SGRNA。供体模板单独提供。

要使用该系统，您首先将SGRNA序列介绍到PTargetF构建体中，然后将两种质粒引入细胞中。现在可以进行染色体中的编辑。编辑后，通过诱导靶向PMB1复制子的SGRNA表达可以从细胞中治愈ptargetf，导致切割质粒。

此时，后续引入的pTargetF包含针对另一个感兴趣的站点的另一个sgRNA，可以用于进行其他编辑。一旦你完成了所有你想要的编辑，通过在37°C培养细胞来治愈pCas9。

新的pEcCas/pEcgRNA系统

我们推测pTargetF的pMB1复制子特异性的pCas上的gRNA可能在BL21(DE3)中表现出更严重的漏表达，我们推测这是导致pTargetF被Cas9切割的原因。这将导致缺乏回收变压器。我们的猜测促使我们更新了pCas/pTargetF系统。

图1:编辑过程从在pEcgRNA中添加sgRNA序列开始。接下来，这两个质粒在大肠杆菌中与供体DNA一起转化，进行编辑。然后质粒从细胞中被治愈。步骤1-1和步骤1-2可以同时完成。从图片李等人，2021年．

这些更新涉及以下更改。在pCas9中，我们1)用PrhaB替换gRNA-pMB1的启动子，2)将pCas的复制子改变为非温度敏感的复制子，3)添加sacB基因进行反选择pEcCas．在Ptargetf中，我们用含有在其末端的Bsai限制酶位点的CCDB基因取代了PtargetF上的原始20bp特定序列pEcgRNA．的ccdB作为反选择标记并将被瞄准感兴趣的基因组位点的sgRNA所取代。

我们比较了pCas/pTargetF系统和更新后的pEcCas/pEcgRNA系统，证实了gRNA-pMB1确实在BL21(DE3)中有略高的泄漏表达，导致pTargetF系列质粒转化效率较低。幸运的是，我们能够使用新生成的pEcCas/pEcgRNA系统成功删除BL21(DE3)中感兴趣的基因。

PECCAS / PECGRNA系统的优点

与原系统相比，pEcCas/pEcgRNA在以下几个方面有优势:

1. PECCAS质粒可在37℃下操作，以便更快地增长其E.．杆菌并且添加sacB基因有利于质粒的清除。
2. 更新Pecgrna质粒上的间隔物（20nt）是更方便的，因为只需要两种24个NT寡核苷酸，并且Bsai线性化的Pecgrna主链可以大量制备并冷冻以供将来使用或直接连接用退火的24 nt寡核苷酸来产生新的Pecgrna。
3. Peccas / Pecgrna不仅可以应用于Coli K-12菌株，还可以应用E.．杆菌B株和W株。
4. 优化后的质粒固化方法简单，只需32小时，而不是60小时。

我们成功测试pEcCas/pEcgRNA系统在4E.．杆菌K-12菌株，2E.．杆菌B株，1E.．杆菌W菌株Tatumella Citrea.，共编辑了70个站点。我们优化了质粒固化的策略，为用户提供了完整的编辑过程。

MUCICAT系统

虽然上面的系统是伟大的实验，只需要单染色体整合(例如:基因组编辑)，我们的Mucicat系统这是基于crispr相关转座酶系统，最适合多拷贝染色体集成（例如蛋白表达）（张等人，2020）。基因表达的多拷贝染色体整合是替代与基于质粒的表达，这可能是不稳定的，并且对拷贝数进行精确控制。

MUCICAT系统包含4个质粒：PDONOR，PTNSABC，PQCASCADE和PCUTAMP。

• pDonor携带可定制的RE-cargo- le (RE，右端;勒,左端)
• PTNSABC表达转座酶TNSA，TNSB和TNSC
• pQCascade表达转座酶TniQ、Cas蛋白Cas6、Cas7、Cas8和crRNA。crRNA的间隔也可以定制，包括连接到针对大肠杆菌多个不同位点的crRNA阵列。
• pCutamp通过靶向所有三个质粒中的ampR启动子来治愈质粒。然后用sacB反选择去除pCutamp。

MUCICAT工具包包括不同诱导系统的质粒版本，如PT7、pra、pet和Para。pDonor质粒pRE57-Ter具有多个终止子，可在代谢工程中阻断基因(或基因簇)。

到目前为止，我们使用MUCICAT系统的方式有两种:

1. 在我们的初始论文中，我们使用MUCICAT来优化葡萄糖脱氢酶的基因剂量，并产生葡萄糖脱氢酶表达的菌株，与产业菌株相比，葡萄糖脱氢酶表达是2.6倍。
2. 在我们的n -乙酰氨基葡萄糖生物合成代谢工程案例研究中，我们构建了一个包含1-11拷贝整合基因的菌株库。我们获得了一个稳定的高产菌株，其产量是工业菌株的6倍。MUCICAT不仅更好，而且更快。使用MUCICAT只需要2个新构建的质粒(pDonor和pQCascade)，经过4轮转化，即可在8天内完成n -乙酰氨基葡萄糖菌株库的构建。为了建立一个等效的菌株库，我们的pEcCas/pEcgRNA系统需要在30天内构建13个质粒，进行14轮转化。

图2：（a）用于多拷贝集成的MUCICAT质粒。（b）Anhydrootetracycline（ATC）诱导表达转座酶，导致积分频率增加。（c）越来越多的转子诱导琼脂转移导致较高的货物拷贝数。（d）基因剂量对N-乙酰葡糖胺浓度的影响。来自阳实验室的图像。

综上所述，MUCICAT系统具有以下优点:

• 无需使用筛选标记的快速和现场特异性的多拷贝染色体集成。
• 具有构建不同基因剂量菌株库的能力，便于快速优化菌株。
• 多种诱导系统可供选择。
• 为代谢工程准备与改良货物专用于基因(集群)中断。

每个系统的质粒可从addgene获得。如果您提供了任何这些系统，我们都喜欢听听您的反馈！

谢谢我们的客人博主！

李琪于2019年获得中国科学院分子植物卓越研究中心博士学位。她加入四川师范大学，同年成为生命科学学院讲师。她的研究重点是微生物基因组编辑的逃逸机制，可用于基因组编辑工具的优化。

张洁泽(Jieze Zhang)是南加州大学生物化学专业的本科生。自2020年12月起，在中科院分子植物卓越中心杨实验室实习。他的研究重点是细菌中转座子编码CRISPR/Cas系统的效率，特别是对效率低的菌株进行优化。

杨胜博士毕业于中国科学院上海生物化学研究所。2000年加入上海生物科学研究院，2006年成为合成生物学教授。的杨实验室的研究重点是开发微生物基因组编辑工具，以更快地构建或重新编程细胞，以了解其不同表型背后的遗传和生化机制，并为绿色化学和生物医学应用设计新一代工程细胞。

义文张于2019年9月进入了CAS CAS卓越卓越中心的卓越实验室，作为博士学位。候选人。她的研究主要侧重于基于CRISPR相关换置的多重基因组编辑系统的开发和应用。

参考资料

引用:

(in chinese with english abstract大肠杆菌基因组通过CRISPR-CAS9系统。Appl Environ Microbiol 81：2506-2514。https://doi.org/10.1128/aem.04023-14

关键词:crispr - cas9, pCas/pTargetF，基因组编辑，基因工程abstract大肠杆菌．Acta Biochimica et Biophysica Sinica。https://doi.org/10.1093/abbs/gmab036

Addgene博客上的其他资源:188博金宝官网

• 浏览我们的CRISPR文章CRISPR主题概述
• 找到其他细菌的CIRSPR方法
• 找到所有有关微生物学的文章

addgene.org的资源：

• 参观CRISPR指南
• 得到来自addgene的Crispr质粒