克服AAV大小对CRISPR传递的限制

Beth Kenkel于2015年7月14日发布，于2020年9月16日更新。

CRISPR基因组编辑已经迅速成为一种流行的系统在体外还有种系基因组编辑，但是在活的有机体内基因编辑方法一直受到Cas9传递问题的限制。腺相关病毒载体(Adeno-ass188完整比分直播ociated virus vector, AAV)是一种常用的病毒载体在活的有机体内基因传递由于其低免疫原性和血清型范围允许某些组织优先感染。然而，包装酿脓链球菌（SpCas9）和gRNA一起（~4.2kb）形成AAV载体是一项挑战，因为其AAV的包装容量（~4.7kb）。虽然这一方法已被证明是可行的，但它几乎没有为额外的监管要素留出空间。冯张的组先前将Cas9和多个gRNAs包装成单独的AAV载体，增加了整体包装能力，但需要两种AAV的纯化和联合感染。

Cas9直系基因:更短，但同样有效和特异?

上述两种AAV策略均成功实现了目标改装，说明AAV是Cas9良好的运载工具。然而，为了给调控序列留出更多空间，同时仍能将Cas9及其grna适合于一个AAV, Cas9必须被做得更小。以前试图“缩小”Cas9的尝试包括使用St1Cas9 (~3.3 kb)乳酸链球菌以及一个合理设计的被截断的Cas9。不幸的是，某些缺点限制了这些系统的效用:St1Cas9需要一个非常特定的PAM序列，这限制了可靶向位点的数量，截断的Cas9的效率比野生型Cas9低得多。

为了寻找一种更小但同样有效的Cas9蛋白，Zhang实验室采取了不同的方法。他们分析了600多个Cas9正射影像发现它们可以分为两组:长直系细胞大约有1350个氨基酸，其中包括SpCas9，短直系细胞大约有1000个氨基酸。只能从短的直系血友病中找到金黄色葡萄球菌Cas9 (SaCas9, 1053氨基酸)在哺乳动物细胞中表现出切割活性。SaCas9产生indels的效率与SpCas9相似，这使得研究小组将他们的努力集中在SaCas9的特性上在活的有机体内研究。

CRISPR/Cas9基因组编辑的缺陷之一是潜在的非目标效应．为了比较SpCas9和SaCas9的脱靶效应，Zhang的团队使用了一种名为BLESS(直接)的方法原位断裂标记，富集链霉亲和素和下一代测序)。通过这种敏感的方法，他们发现SaCas9并不比SpCas9表现出更高水平的脱靶活性，这证实了它的适用性在活的有机体内研究。

测试AAV-SaCas9在活的有机体内

测试AAV-SaCas9的效率在活的有机体内在美国，Zhang实验室使用肝脏特异性血清型AAV8创建了一个一体化SaCas9和sgRNA构建。由于CRISPR/Cas9基因组编辑的效率因靶标而异，他们在小鼠中测试了两个基因。对于这两种基因，他们早在注射后一周就观察到indel的形成和表型的变化。与对照组AAV-GFP相比，这些小鼠的肝脏组织学正常，肝损伤标志物没有增加。AAV-SaCas9-sgRNA不仅介导了基因组修改，而且没有实质性的免疫反应或毒性。

更多基于aav的CRISPR系统

较小的Cas蛋白质

SaCas9并不是唯一小到可以装入AAV的CRISPR酶。

• 长度为984个氨基酸，Cas9来自空肠弯曲菌(CjCas9)是迄今为止最小的Cas9直系谱。金等。成功地利用CjCas9和AAV靶向小鼠肌肉和眼组织中的基因。
• 脑膜炎奈瑟菌Cas9（NmeCas9）1082个氨基酸，也可以包装成AAV。NmeCas9有一个额外的优点，它可以被关闭抗CRISPR蛋白。Sontheimer实验室使用NmeCas9和AAV在小鼠肝脏中编辑两个不同的致病基因座．
• 另外两种较小的Cas蛋白包括Cas12b和CasX。然而，目前还没有发表的论文将这些Cas蛋白与AAV结合，分别只有1108和986个氨基酸，两者的大小都在AAV的包装限制之内．
• 为CRISPR-based RNA编辑该修复(RNA编辑可编程A到I替换)系统也足够小，可以交付AAV。该系统催化地将死的dCas13b融合到RNA脱氨酶ADAR2的催化结构域。包含ADAR2截断ADAR2DD(delta984-1090)的结构大约有4.1 kb长，允许它们被打包在AAV中。

分裂AAV方法

虽然寻找更小的Cas9直方图适用于某些应用，但这并不能消除交付更大的货物的需要，比如基本编辑和'编辑. 虽然使用AAV传递大的转基因似乎令人望而生畏，但这实际上是该领域克服的一个挑战分裂装甲防护．一般来说，split AAV将一个大的转基因分成两部分，并将每一部分包装成一个单独的AAV。当细胞被两种aav转导时，全长基因和/或蛋白质被重组。

重建像Cas9这样的分裂蛋白的一种方法是使用分裂蛋白。分裂蛋白是一对自然产生的多肽，当在两个蛋白质的末端时，介导蛋白质的反式剪接，类似于mrna前剪接中的内含子。在2016年,罚款等开发了一种概念证明分裂蛋白SpCas9，与全长SpCas9相比，它在HEK-293T细胞中具有适度的编辑率。在2016年,咀嚼et al。开发了一个split intein spCas9-AAV工具箱保留了全长SpCas9的基因靶向能力。这组质粒包括AAV-Cas9C-VPR用于靶向基因激活。分裂的基因也被用来表达碱基编辑器。

工具书类

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