选择B(右)est荧光蛋白的实用方法

客人的博客

客人的博客2017年6月1日

这篇文章是由阿姆斯特丹大学分子细胞学部门和先进显微镜Van Leeuwenhoek中心的客座博主Joachim Goedhart和Marieke Mastop贡献的。

在你决定买哪一辆车之前，先试驾几辆候车是值得的。在你买一个新的显微镜之前，最好先看(并仔细检查)几个模型。在你开始一个新项目之前金宝搏app下载，最好的建议是尝试一些有希望的变体，以检查它们在你的实验条件。这段时间花得很好，如果你做得好，可以成为你下一篇论文或论文中图1的一部分。这一系列的文章解释了如何批判性地评估已报道的荧光蛋白的性质，如何对荧光蛋白进行正面比较，以及如何在充分知情的情况下决定最佳荧光蛋白金宝搏app下载你的应用程序。

为特定的应用选择最佳的荧光蛋白似乎是一项艰巨的任务。许多荧光蛋金宝搏app下载白是可用的，并且荧光蛋白的数量正在稳步增加。通常，对荧光蛋白的选择是基于在文献中发现的特性或在网站上总结荧光蛋白特性的表格数据。金宝搏app下载为了做出最佳选择，需要在相关条件下对荧光蛋白的性质进行详细的研究。

荧光蛋白的性质通常只在少数条件下检查金宝搏app下载，因为不可能检查所有可能的生物和设备组合。由于荧光蛋白的性能在很大程度上取决于生物系统和成像方法，我们建议您在最能模拟预期应用的条件下进行小规模的头对头比较研究。活细胞成像的三个关键属性将在本系列文章中处理(i)亮度，(ii)耐光性(三)聚集趋势。

亮度

亮度是指荧光分子的荧光强度。高亮度会增加检测到的信号，因此高亮度是荧光团的一个重要特征。关键问题是如何最好地定义或确定亮度。在这里，我们将解释如何确定实际亮度，以及为什么实际亮度是选择最亮荧光蛋白比理论亮度更好的标准。

理论上的亮度

决定荧光团亮度的两个关键特性是激发光被吸收的程度和被吸收光子转换为发射光子的效率。它们分别由消光系数(EC)和量子产率(QY)表示。理论亮度是通过EC乘以QY (EC*QY，有时归一化为EGFP的值)来计算的。数值越高，理论亮度越高。理论亮度经常出现在荧光蛋白性质的表格中，并提供了一种快速比较荧光蛋白的方法，例如，参见金宝搏app下载Chudakov等人(2010)，Cranfill等(2016)或刺(2017)．然而，理论亮度忽略了与成像策略和样品有关的几个重要实验条件。

实际的亮度

具有高固有亮度的蛋白质，如果不能很好地折叠或不能在显微镜设置中检测到，则实际亮度为零，没有用处。因此，在您的实验设置中，根据荧光蛋白的实际亮度进行比较更为合理。金宝搏app下载实际亮度考虑到所有应用的特定参数，包括显微镜的规格(激发波长，可用的发射过滤器，检测器灵敏度)和生物系统(温度，原核生物与真核生物，背景荧光)。

确定实际的亮度

当一盘哺乳动物细胞转瞬即逝时转染含有a的质粒荧光蛋白(融合)在培养皿中单个哺乳动物细胞的荧光强度有很大的差异。这是由细胞摄取质粒的随机性造成的。为了纠正这种变异，以相同水平表达的参考荧光蛋白(Goedhart等人，2011年)可以使用。

一个分析我们实验室开发的参考蛋白是从相同的开放阅读框中翻译出来的，并由a2裂解肽（Goedhart等人，2010年）.图1描述了该分析的解释。感兴趣的荧光蛋白与参考蛋白之间的严格相关性(Goedhart等人，2011年)可以在真实的实验条件下精确测定细胞的亮度。通过测定一组荧光蛋白(具有相同参考蛋白)在相同条件下的亮度，可对实际亮度进行排序(金宝搏app下载Goedhart等人，2012年，Bindels等人，2017年）.mTurquoise2与mVenus共同表达的质粒可从Addgene．

以细胞为基础的测定实际亮度

另一种避免在哺乳动物细胞中观察到的细胞变异的方法是标记内源性基因．通过成像细胞(或组织)产生一种内源性蛋白质，标记一种荧光蛋白，然后再用另一种荧光蛋白重复这一过程，就可以得出实际的亮度等级。这一策略已被用于酵母Lee等人(2013)在线虫中El Mouridi等(2017)和Heppert等人(2016)．在哺乳动物细胞中，这是可能的CRISPR / Cas-based基因组编辑．

选择一个明亮的荧光蛋白

实际亮度考虑了所有的实验条件。特别是荧光蛋白在宿主细胞中的折叠和成熟效率，这是实际亮度的关键决定因素。因此，实际亮度比理论亮度提供了一个更好的画面，可以在“实际”应用中预期什么。因此，识别一些有前景的荧光蛋白，并在一个密切模拟未来应用的系统中确定和比较它们的实际亮度是有意义的。金宝搏app下载在图2中，我们提供了一个比较两个橙色荧光蛋白实际亮度的例子，只有一个氨基酸不同。金宝搏app下载如果没有关于光稳定性或聚合倾向等特性的进一步信息，我们的选择将是mKOk-2A-mTq2；它比mKO2-2A-mTq2根据这个数据。实用的亮度分析(使用共同表达的荧光蛋白或内源性标记基因)可用于验证不同成像条件(例如不同的发射滤光片)或不同设置金宝搏app下载下的性能。