许多需要在特定细胞类型中表达基因的神经科学实验，依赖于在感兴趣的细胞中表达Cre或Flp等重组酶的转基因模型和依赖重组酶的AAV载体进行选择性转基因表达。虽然这是一种强大的实验策略，但我们在Addgene中对该系统最常见的担忧之一是重组酶依赖的AAV载体的脱靶或虚假表达。在这篇文章中，我们将讨论一些脱靶表达的原因和优化实验的方法来最小化它。
DIO/FLEx矢量设计概述
重组酶依赖的载体利用一对对特定序列，lox (Cre识别)或frt (Flp识别)，来翻转或切除位于它们之间的基因。早期的重组酶依赖载体设计在ATG起始密码子之前使用lox-STOP-lox (LSL)或frt-STOP-frt (FSF)序列来阻止重组酶不存在的细胞中的转录(Kuhlman, SK. 2008)。虽然理论上这种策略应该有效，但这些载体遭受了高水平的虚假表达。
因此，研究人员开发了一种新的工具，称为FLEx/DIO载体，其中转基因由两对重组位点固定，开放阅读框相对于启动子倒置，因此命名为double-floxed inverted open-reading frame (DIO)，或FLip-EXcision (FLEx) vector。这两个重组位点都被Cre识别，但它们由不同的序列(loxp和lox2272)组成，不能相互重组。当Cre被引入到系统中时，它会结合一对lox位点，假设是loxp对，并使转基因进入正确的转录方向。在重组后，lox2272位点将夹在2个loxp位点之间，并被Cre切除(图1)。这导致转基因两端各有一个loxp位点和一个lox2272位点。由于loxp和lox2272不能重组，这就确保了转基因不再能够翻转回反方向(见质粒101:FLEx载体)．虽然这种策略大大降低了转基因脱靶表达的总体水平，但在许多系统中仍然观察到低水平的虚假表达。那么这个假表达式的原因是什么呢?
 |
| 图1所示。Cre-recombinase结合对lox网站,假设lox2272,在相反的方向(箭头方向)倒转基因恢复到取向和一个未使用的(loxp)网站将两侧是两个lox网站现在在同一个方向。接下来，loxp位点被切除，因为它位于两个lox2272位点之间，以防止转基因逆转。图创建BioRender.com |
重组和漏表达的原因
虽然漏表达和自发重组是DIO/FLEx载体的已知问题，但这些事件的原因直到最近才为人所知。Ed Callaway实验室最近发表的一篇论文(费舍尔,KB。2019)从质粒在细菌中扩增到转基因表达，通过分析质粒和病毒的DNA序列和表达谱，系统地测试这些现象的潜在原因在活的有机体内．
由于DIO/FLEx载体包含两组同源重组位点，他们推测这些位点之间的自发重组可能是导致表达渗漏的原因。为了验证他们的假设，他们随机打乱了一对lox位点，要么使用相同的序列来侧切转基因(同源对)，要么使用不同的打乱序列来侧切转基因(非同源对)(图2)。他们发现几乎所有的脱靶表达都可以归因于同源对之间的自发重组，并且同源程度与自发重组的水平相关。这表明，泄漏的表达量很大程度上可以归因于在病毒包装开始之前同源对之间的自发重组水平。这种自发的重组甚至在重组酶缺陷的大肠杆菌，在尽量减少重组的条件下通常用于病毒质粒扩增(费舍尔,KB。2019)．这意味着所有DIO/FLEx AAV载体都会有一定程度的重组，在不表达Cre或Flp的细胞中导致漏表达。
在Addgene，我们使用下一代测序(NGS)对每一批含有DIO/FLEx盒的AAV载体的转基因重组量进行了量化(吉林,k . 2020)．一般来说，我们观察到0.1 - 0.8%的包装病毒基因组含有重组/功能转基因，可以在Cre缺失的细胞中表达。此外，我们还发现一些载体更容易重组，重组水平可高达1-3%。鉴于这一发现，我们现在在DIO/FLEx AAV载体的质粒页面上包含了出现这种情况的指南，提醒科学家在使用它们时要谨慎。
 |
| 图2。AAV质粒扩增过程中自发逆转机制示意图。在左边的同源对上，杂乱的cre-重组酶位点导致更大频率的逆转和漏表达。在右侧非同源干扰重组瞄准镜导致逆转减少和更少的脱靶表达。图创建BioRender.com |
优化表达策略
既然我们知道AAV DIO/Flex载体会发生自发重组，不表达Cre或Flp的细胞也会发生渗漏表达，我们能做些什么呢?
检测血清型和启动子
第一步是了解要使用的AAV矢量在系统中的性能。这包括对血清型和启动子进行彻底的测试在活的有机体内实验来确定最佳/最小注射滴度和所需的体积，以在您感兴趣的细胞中获得充分的表达。
所使用的AAV血清型在细胞类型(星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元等)之间甚至在混合群体中的神经元表型之间可以显示出深刻的趋向性差异(Burger, C. 2004, Aschauer, DF。2013年,阿'Carroll, SJ。2021)．这是由于AAV利用受体表达、翻译后修饰和其他因子的差异而进入细胞(杜德克,。2018)．
如果你使用的血清型能更有效地转导你不感兴趣的细胞，它可能导致更大的脱靶表达仅仅因为更多的病毒颗粒进入这些细胞。因此，任何AAV实验的第一步是了解哪种血清型能最好地转导你感兴趣的细胞。我们建议测试几种不同的血清类型，以确定哪一种对你感兴趣的细胞是最好的。
根据血清型确定注射滴度和剂量
由于每种血清型从注射部位也表现出不同的传播模式，因此建议尝试几种不同的注射滴度和剂量，以确定所需的最佳注射参数，以转导你感兴趣的细胞。在此步骤中使用组成表达载体可以节省时间，因为它减少了DIO/FLEx载体和脱靶表达可能遇到的变异性，从而更容易确定注射部位周围的扩散模式。
测试启动子
在你的细胞中对启动子进行彻底的测试也是很重要的。一些启动子(如CAG)非常强，可能需要更少的病毒颗粒或相对较短的表达时间，而另一些启动子(如hSynapsin)相对较弱，可能需要更长的等待时间和/或更高的注射滴度才能达到充分的表达。在数周内进行时间过程实验来检查表达水平，研究人员可以确定进行实验的最佳时间。从长远来看，这可以节省你的时间，因为没有这个信息可能会导致你在开始实验之前等待的时间超过必要的时间，或者如果你在达到足够的表达之前开始实验，你可能会得到假阴性或得出病毒载体不起作用的结论。当使用“细胞类型特异性”启动子时，例如被截断的酪氨酸羟化酶(TH)儿茶酚胺神经元或胶质细胞的启动子纤丝的对于星形胶质细胞的酸性蛋白(GFAP)，在感兴趣的脑区测试它是重要的，特别是当使用DIO/FLEx载体进行脱靶表达时。某些类型的神经元在发育过程中短暂表达TH或TH mRNA水平较低，但不表达TH蛋白，提示有启动子活性。此外，一些神经元表达低水平的GFAP，这可能导致包装后的转基因在神经元和胶质细胞中的脱靶表达。
检查重组率
优化DIO/FLEx矢量的第一步是知道所使用矢量的重组率。联系Addgene (help@addgene.org)，或您的载体供应商，以获得此信息。
优化DIO/FLEx载体滴度
一旦确定了最优的血清型注射参数，可以最好地转导感兴趣的细胞，现在就可以开始优化DIO/FLEx载体。这个步骤基本上和优化血清型的步骤是一样的，除了现在你已经有了一个“最佳”注射量和滴度开始。现在你主要只需要调整滴度，以尽量减少脱靶表达，同时仍能在你感兴趣的细胞中获得足够的表达。你现在应该可以对你的动物模型的一组注射做更小的调整。例如，在Wickersham实验室最近的一项研究中(拉文,TK。2020)结果表明，用于追踪神经通路的敏感FLEx-split TVA受体的最佳滴度为8.5 x 10e10 GC/mL。本研究使用的这批病毒(100798-AAV，批号#v15287，效价1.7x10e13 GC/mL和100799-AAV1，批号# v14715，效价2.4x10e13 GC/mL)包装在Addgene上，重组率相对较低(分别为0.1%和0.13%)，但仍需要200-300倍稀释才能减少脱靶表达。由于每批AAV载体的重组率各不相同，因此可能需要对每批使用的新载体或新载体进行一系列稀释和/或注射量的测试。
遵循这种逐步优化将花费相当多的时间，并且可能很容易跳过一些步骤并进行实验。然而，通过首先优化所有条件，确保最小化任何可能影响结果的脱靶表达，从长远来看，您将节省时间、挫折和资金。
结论
在您的实验中使用AAV向量需要充分了解系统中的向量性能。是非常罕见的方法部分,包括所有的变量需要占(即血清型、启动子、效价、缓冲区等),这可能会导致误解,如果使用一个向量与以前相同的效价和血清型在不同的大脑区域,相同的结果将会实现。事实上，在每一个系统和细胞类型中，都有许多已知和未知的因素影响载体的性能。因此，每一个新的载体，无论是一个全新的转基因，还是仅仅是一个新的批次，在开始大规模实验之前，都必须在研究人员的系统中进行彻底的测试。这将有助于确保数据的准确性和可重复性，并能在解释结果时灌输更大的信心。
引用和资源
参考文献
Aschauer DF, Kreuz S, Rumpel S (2013) AAV血清型1、2、5、6、8和9在小鼠大脑中的转导效率、趋向性和轴突转运分析。《公共科学图书馆•综合》8:e76310。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076310
Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N(2004)重组AAV病毒载体，病毒衣壳来自1、188完整比分直播2和5血清型，在传递到中枢神经系统的不同区域后显示出不同的效率和细胞向性。分子疗法10:302 - 317。https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2004.05.024
(2018)腺相关病毒(Adeno-associated Virus, AAV)独立于AAV受体的进入途径。92年J微生物学报。https://doi.org/10.1128/jvi.02213-17
重组酶依赖的AAV载体的脱靶表达来源和交叉不敏感的ATG-out载体的缓解。美国国家科学院学报116:27001-27010。https://doi.org/10.1073/pnas.1915974116
Guerin K,“政府改造”,布尔日D,人我,Haery L, Harten DeMaio K,桑德斯E, Tasissa M, Kostman M, Tillgren M,汉利的马卡拉L,穆勒,Mitsopoulos,风扇M(2020)小说下一代测序和分析平台评估重组腺相关病毒制剂的身份从病毒DNA提取。人类基因治疗31:664-678。https://doi.org/10.1089/hum.2019.277
Lavin TK, Jin L, Lea NE, Wickersham IR(2020)单突触追踪的成功关键取决于辅助病毒浓度。前突触神经科学12。https://doi.org/10.3389/fnsyn.2020.00006
O’carroll SJ, Cook WH, Young D(2021)靶向中枢和外周神经系统胶质细胞类型的AAV及其与人类基因治疗的相关性。13.神经科学前沿https://doi.org/10.3389/fnmol.2020.618020
留下你的评论