这篇文章由客座博客作者Didem Goz Ayturk撰稿，Didem Goz Ayturk是哈佛医学院Connie Cepko实验室的博士后研究员，由Addgenie Karen Guerin编辑。
腺相关病毒（AAV）已成为研究和临床应用中最受欢迎的病毒工具。AAV可用于在多种细胞类型中瞬时表达感兴趣的基因。大约50年前，它第一次被描述为腺病毒制剂的污染物，因此得名(艾奇逊等人，1965年AAV是一种单链DNA病毒，属于细小病毒科。它有一个包装在二十面体衣壳中的“简单”基因组。它没有脂质外壳，也称为包膜，因此不能支持在其表面添加糖蛋白，如VSV-G。在研究应用中，基因组通常被掏空，这样就为基因传递和安全打开了宝贵的空间。通过提供编码复制酶功能和衣壳蛋白的基因，你可以很容易地在组织培养环境中补充病毒，换句话说，在“反式”环境中。这使得研究人员能够在受控环境下制造更多的病毒。虽然AAV是从广泛的生物体中分离出来的，但它与疾病没有关联，被认为是生物安全级别1 (BSL1)的病毒制剂。
完美重组AAV (rAAV)工具的四个考虑
AAV可用于多种应用，包括特定细胞类型的瞬时基因表达，CRISPR基因组编辑，光遗传学和化学遗传学实验。如果你是新的利用RAVS作为基因传递工具的话，下面是一些你在开始之前应该考虑的事情：
1.载货量
即使是被破坏的rAAV也有约4.7kb的载重量，这是该病毒基因传递的关键限制之一。然而，如果你感兴趣的基因足够小，你可以设计一个包含两个基因的rAAV载体，并使用如下元素：忿怒或2，从一个启动子共同表达。如果滴度高，不同RAAV的共同感染率也相当高，因此如果你不能将两个基因都整合到一个载体中，你可以共同感染（尽管这可能并不总是有效）体内）.
2.特异性
有几种不同的rAAV组分可以驱动特定细胞/组织中的基因表达;其中包括启动子，Flp或Cre依赖性基因开关和血清型（血清型将在下文详细讨论）。如果你的目标是广泛表达，一个广泛活跃的启动子，如CAG（鸡β肌动蛋白启动子与CMV立即早期增强子），是一个很好的选择。如果你有一个特定的靶细胞类型，你可能想尝试不同的启动子，例如神经元特异性启动子的Camk2a。另一方面，具有Cre-或Flip依赖性基因表达的rAAV载体可注射到在特定细胞类型中表达Cre或Flp的动物体内，从而仅在这些细胞中产生基因表达。
3.血清型
衣壳蛋白是rAAV载体的重要组成部分，是这些载体生物学的驱动力。尽管多项研究表明不同血清型感染不同细胞型的能力不同，但最近的一项研究表明，大多数（或所有）血清型使用相同的受体（AAVR）(皮莱等人，2016年）.所观察到的向性可能是由于其他因素，如病毒粒子附着在细胞表面，或可能是进入后的步骤，如脱壳。
AAV术语可能会令人困惑。您可能会看到AAV2/2或AAV2/8等名称，但这些数字实际上意味着什么？第一个数字代表反向终端重复（ITR）类型。ITR是位于AAV基因组两侧的短DNA序列，允许其在宿主细胞中形成融合体。它们与Rep蛋白一起，促进在染色体19上的AAVS1位点整合到人类基因组中，这仅在野生型AAV中观察到，而非载体形式。几乎所有载体都包含类型2 ITR。类型2ITR可与多种衣壳类型一起包装。用于包装rAAV载体（即血清型）的衣壳类型用第二个数字表示。例如，如果rAAV载体的ITR类型为2，衣壳类型为8，则表示为AAV 2/8。
4.基因组
野生型AAV是单链DNA病毒。DNA脱衣后，病毒依靠宿主细胞复制机制合成互补DNA链。这一步骤被认为是rAAV转导效率的限制因素。为了克服这一问题(麦卡蒂等人，2001年)通过突变其中一个ITRs，构建二聚体或自互补AAV（称为scAAV）。scAAV载体比ssAAV起效快（天），转基因表达水平更高。然而，它们的包装容量（<2.5Kb）是ssAAV（<4.8Kb）的一半，限制可以成功包装的基因和调控元件的数量。
如果你需要快速的转基因表达，caav可能是有价值的。较低的滴度可以达到理想的转基因表达水平，最大限度地减少由于高病毒粒子浓度而出现毒性或免疫原性的机会。
快速补充说明：您可以使用逆行AAV绘制神经元连接图。
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图1:ssAAV和scAAV基因组的比较、包装和转导。摘自Takashi Okada（2013）。高效AAV载体生产系统：Duchenne肌营养不良症的基因治疗，基因治疗-工具和潜在应用，Francisco Martin博士（编辑），内政部InTech:10.5572/53023。 |
制作你的rAAV
在全国范围内有几个设施可以获得优质、高滴度的rAAV(包括艾德金！)，但您也可以使用标准的分子生物学工具和组织培养经验在自己的实验室中生成RAAV。
简而言之，首先用携带感兴趣基因的rAAV载体、腺病毒辅助质粒和含有Rep和Cap的质粒（图2，通常称为“三重质粒转染”）转染HEK293T细胞。2-3天后，收集上清液，（或在某些情况下，由于某些rAAV血清型被释放到培养基中，而其他rAAV血清型则没有释放到培养基中，因此制造细胞提取物）(范登伯格等人，2010年)用聚乙二醇沉淀病毒粒子。然后使用高速超离心机通过密度梯度离心进一步纯化病毒粒子。由于病毒粒子密度高，它们会形成一条条带，你可以从梯度中收集这条条带。然后通过透析/缓冲液交换去除密度梯度物质，如果需要可以进一步浓缩病毒粒子。
可使用针对病毒基因组和/或蛋白质凝胶的引物，通过qPCR对病毒粒子制备进行滴度（Veldwijk等人，2002年)。这些滴度是针对物理粒子的，其中许多粒子没有传染性。物理粒子与传染性粒子的比率可能相差很大，从1到>100。
AAV病毒粒子相当稳定。它们可以经受冻融循环和脱水，这可能会使你的工作台、离心机或培养箱中先前准备的污染。为了减少这种情况，你应该对所有与AAV接触的一次性物品和表面使用消毒剂，如Coverage Plus NPD。同样重要的是，努力应用常见的细胞培养方法。
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图2:重组AAV (rAAV)转移载体通常携带由itr之间选择的启动子驱动的转基因，但不包含Rep/Cap。Rep/Cap ORFs编码病毒基因组复制、病毒粒子组装和60分子病毒衣壳所必需的蛋白质。在这种情况下，Rep/Cap是由组织培养中与转基因质粒共转染的质粒编码的。复制还需要腺病毒辅助质粒，它诱导AAV的溶解生命周期和释放。 |
在活的有机体内rAAV交付
有关AAV交付有几个因素体内这取决于你的生物系统。这些因素在很大程度上影响着你感染的成功程度。无论你的应用程序是什么，下面列出的是在进行注射之前你可能需要考虑的一些参数:
注入效价
你可以输送到组织中的病毒颗粒数量将由你的病毒制剂的滴度和可以输送的最大体积决定，这是非常重要的。不幸的是，如上所述，物理粒子的滴度不能直接转化为您将观察到的值体内，尽管这只是一个起点。你可以从查阅有关特定组织的文献入手，但通常情况下，最佳剂量需要靠经验来确定体内通过尝试一系列稀释。
动物年龄
首先，重要的是要记住，终末分化的细胞(即有丝分裂后的细胞)会有长期的AAV表达，但在分裂的细胞中，AAV的表达会丢失。被注射动物的年龄将决定你能成功感染哪种类型的细胞。(即在早期发育时间点，尚未出生的细胞，即使它们的有丝分裂祖细胞存在，也不会被AAV感染)(熊和Cepko, 2016）
感染可视化
在开始分娩过程之前，你还应该考虑如何想象你的rAAV感染情况。您是否在rAAV构建中包含了报告基因，例如绿色荧光蛋白或mCherry？通过荧光测量，可以很容易地直接观察到表达发生的位置。如果不是，你可以考虑共注射一个带有报告基因的AAV，在同一个启动子下驱动你感兴趣的基因，并测量报告基因的表达作为你感兴趣的基因的代理，这可能不容易检测。如果共同表达或共同感染是不可能的，通过免疫组化或现场杂交可能是你最好的选择。
感染后时间
从注射到组织处理需要足够的时间来检测AAV介导的基因表达。时间在很大程度上取决于衣壳类型和感染的组织。等待2周是许多组织的良好起点。据报道，AAV介导的基因表达相当稳定，持续数周在人类临床试验和狗身上的年数(Wonjo et al.， 2013）.
准备AAV时的注意事项：
| 在设计和成长之前 | 交货时和交货后 |
| 载货量 | 给药效价/体积 |
| 启动子（特异性与广泛性） | 动物的年龄 |
| 血清型-组织/细胞取向 | 感染可视化 |
| 生产（DIY还是购买？） | 感染后时间 |
AAV是一种非常通用的病毒基因传递工具。您特定研究应用的需求将决定AAV设计和传递的适当参数。虽然您最终的血清型/滴度/年龄确定将严重依赖于试点实验，但您可以查阅不断增长的文献，以获得设计建议适用于许多不同的生物系统。在过去二十年中，已经开始了100多个涉及AAV的临床试验，看来在未来几年，该工具将在治疗和基础研究环境中继续流行。
非常感谢我们的客座博主Didem Goz Ayturk！
Didem Goz Ayturk是Connie Cepko实验室的博士后研究员，使用病毒工具研究视网膜的神经元回路。
参考文献
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参考资料在Addgene博客188博金宝官网
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