梅根·雷戈于2021年6月1日更新。
可复制的数据是科学的关键，因此科学家们习惯于重复实验来证实他们的发现。但没有科学家愿意重复实验，因为试剂质量差。为了确保我们的AAV载体具有最高质量，我们进行了严格的质量控制过程。
2016年，我们推出了病毒式服务继续我们加速科学研究的使命。确保Addgene提供的腺相关病毒（AAV）载体适合体内研究，我们的科学家执行所有标准质量控制分析对于AAV。这些步骤包括测量病毒滴度和评估纯度。但Addgene也在进行更严格的质量控制，包括下一代测序（NGS）病毒基因组的确认病毒基因组特性和血清型此外，我们尽可能检查转基因细胞中的病毒转基因表达。这篇文章将描述我们的病毒基因组测序（VGS）工作流程。
你为什么要关心病毒质量控制？
AAV载体是由科学家而不是机器人产生的。不幸的是，人们已经知道人类会犯错误。如果一根管子被错误标记或有人抓住了错误的质粒怎么办？如果细菌在生产过程中偷偷进入制备过程怎么办？这些问题在平行生产多个载体时尤其重要，因为ac的风险偶然错误增加。
除了人为错误外，辅助质粒或细胞基因组的DNA片段在生产过程中也可以包装在载体内。这些杂质在净化步骤中无法去除，因为它们是在…内病毒本身。虽然这些杂质通常被认为对研究级载体无害，但我们希望确保它们的浓度非常低。那么，在分发向量之前，我们如何确保捕捉到所有这些潜在的灾难呢？
病毒基因组测序
由于建立了内部测序能力以及Seqwell的plexWell技术，我们现在可以在Addgene上执行NGS，对病毒颗粒内包装的所有DNA进行测序（图1）。简单地说，从纯化的DNA酶处理的AAV中提取包装的DNA，并提交给NGS。对原始测序数据进行分析，以确定包装DNA的身份和血清型，并寻找潜在的污染物。
分析分为两个步骤，使用遗传的软件：
首先，将单个测序读数（每个读数约150 bp）与用于创建病毒制剂的质粒的参考序列对齐AAV-44362如下图所示，超过90%的读数应与此参考序列对齐。其次，我们对所有未映射到引用序列的读取执行megaBLAST搜索。然后仔细审查最终的点击列表。如前所述，从包装细胞基因组、细菌基因组、克隆载体和辅助质粒中发现DNA是常见的(Chadeuf等人，2005年,Wright等人，2011年).事实上，大多数命中来自这些已知杂质，清洁样品AAV-44362也是如此。除了这些预期的命中率之外，我们总是得到“随机”基因的命中率。这些点击是否总是意味着样本被污染？不，真正重要的是同一序列（基因）的命中数。在一个干净的样本中，一个给定序列的命中率通常不到10次，我们认为这不值得担心。但是，一个序列/基因的大量命中率-我们将阈值设置为>100次-会立即引发一个危险信号。例如，AAV-68544包含220次CHRM4基因的命中率。
当怀疑有污染时，我们继续从头组装利用我们的生物信息学软件，在不使用参考序列的情况下，将未映射的读码组装成更长的DNA重叠群。总读数最多的五个重叠最有可能与污染物对应。然后，每只挫伤动物都会死亡猛烈抨击对照NCBI核苷酸收集数据库，它也可能与我们清单中包含疑似污染序列的质粒对齐。在大多数情况下，可以确定污染源，并且我们将丢弃任何怀疑被污染的AAV制剂. 对于AAV-68544，与污染物最匹配的是Addgene质粒#44362。
方法验证、限制和未来计划
AAV-68544是如何被污染的？我们特意将另一种AAV载体与AAV-68544混合，以验证我们的方法。然后，我们提取DNA并在我们的管道中处理混合样本（见图2，样本2）。当我们盲目分析AAV-68544时，我们很容易识别AAV-44632，即我们以5%的比例混合到原始AAV样品中的污染物。检测5%的污染是一个良好的开端，但为了确定我们的方法的灵敏度，我们想看看我们能降到多低。我们制备了一系列0.1-20%的加标样品，发现如果测序深度足够高，我们可以检测到低至0.1%的污染(Guerin等人，2020年).
除了基因组鉴定，我们还开发了定制开放存取Python脚本这可以对数据进行更深入的分析。我们的血清型检测软件通过询问衣壳质粒特有的小预定种子序列的VGS数据来确认prep的血清型。我们的重组软件寻找并量化重组酶依赖序列中重组子的存在。重组酶依赖在细菌的质粒生长或病毒生产过程中，nt序列可能会进行非重组酶的重组。这种重组会产生一个不需要重组酶进行转基因表达的小预重组群体。一旦包装在AAV中，这种预重组DNA可能会导致在重组酶中进行转基因表达ase阴性动物，产生误导性结果。到目前为止，我们已经分析了数百种病毒载体，并估计在给定病毒制剂中0.1-0.6%的AAV颗粒中发生了非重组酶重组。考虑到这一点，我们建议用户滴定其AAV载体，以找到允许充分转基因的最佳剂量但限制了重组酶独立表达的可能性。188完整比分直播
下一代测序（NGS）是一个强大的工具，可用于确定AAV制剂中的DNA污染物，并提供有关这些DNA物种的详细信息(Lecomte等人，2015年)。建议对临床级材料进行更高水平的质量控制，但目前尚未要求，研究级材料通常不需要进行更高水平的质量控制。Addgene将继续努力，率先系统地使用这种新的质控分析方法，以确保您的研究获得最佳的AAV载体。
如果您对病毒DNA NGS有任何具体问题需要我们讨论，请使用下面的评论部分让我们知道。我们也可以通过电话或help@addgene.org回答您有关我们质量控制流程的问题！
这篇博文中的图片是使用Snapgene和Geneious软件创建的。
参考资料和资源
工具书类
Chadeuf G，Ciron C，Moullier P，Salvetti A（2005）重组腺相关病毒生产过程中原核序列包封的证据及其载体交付后的体内持久性。分子治疗12:744–753。https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2005.06.003
Guerin K、Rego M、Bourges D、Ersing I、Haery L、Harten DeMaio K、Sanders E、Taissa M、Kostman M、Tilgren M、Makana Hanley L、Mueller I、Mitsopoulos A、Fan M（2020）一个新的下一代测序和分析平台，用于评估来自病毒DNA提取物的重组腺相关病毒制剂的身份。人类基因治疗31:664–678。https://doi.org/10.1089/hum.2019.277
Lecomte E、Tournaire B、CognéB、Dupont J-B、Lindenbaum P、Martin Fontaine M、Broucquee F、Robin C、Hebben M、Merten O-W、Blouin V、François A、Redon R、Moullier P、Léger A（2015）通过单链病毒下一代测序对rAAV载体制备中的DNA分子进行高级表征。分子治疗-核酸4:e260。https://doi.org/10.1038/mtna.2015.32
Wright JF，Zelenia O（2011）重组腺相关病毒质量控制测试的载体表征方法。载：分子生物学方法。人类出版社，第247-278页
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