为基因传递到中枢神经系统和PNS而创建的AAVgydF4y2Ba

腺相关病毒(AAV)gydF4y2Ba向量是gydF4y2Ba在大脑和脊髓的研究中最常用的基因转移工具，这两种神经系统统称为中枢神经系统(CNS)。gydF4y2Ba．aav是一种流行的工具，因为:1)它们的基因组易于操作，2)它们具有长期表达;3)它们的毒性有限。然而，将AAVs用于神经科学研究的一个关键挑战是缺乏一种通过基因操纵整个大脑神经元的方法。外周神经系统(PNS)的神经元连接心脏、肺、肠和其他器官和中枢神经系统，也是基因传递的重要靶点，gydF4y2Ba尤其是对疼痛的研究gydF4y2Ba. 虽然许多新的衣壳（即决定向性的病毒部分）已经被开发出来，可以提高转导效率，但没有一种衣壳能够同时简单有效地转导CNS和PNSgydF4y2Ba加州理工学院Gradinaru实验室gydF4y2Ba年代gydF4y2BatgydF4y2BaegydF4y2BapgydF4y2BapgydF4y2BaegydF4y2BadgydF4y2Ba向上gydF4y2BatgydF4y2BaogydF4y2BatgydF4y2BahgydF4y2BaegydF4y2BacgydF4y2BahgydF4y2Ba一个gydF4y2BalgydF4y2BalgydF4y2BaegydF4y2BangydF4y2BaggydF4y2BaegydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在这里找到PHP质粒!gydF4y2Ba

他们的解决方案:gydF4y2Ba使用CREATE方法设计两个新的静脉注射AAV衣壳，AAV. php . eb和AAV. php。S，分别针对中枢神经系统或中枢神经系统。gydF4y2Ba

继续读下去，了解更多关于这两种新的AAV衣壳，以及它们如何成为研究中枢神经系统和PNS的有用工具!gydF4y2Ba

什么是CREATE方法?gydF4y2Ba

创建代表gydF4y2BaCgydF4y2Ba再保险gydF4y2BaRgydF4y2Baecombinase-basedgydF4y2Ba一个gydF4y2BaAVgydF4y2BaTgydF4y2BaargetedgydF4y2BaEgydF4y2Ba涡旋。在这项技术中，产生了一个突变型AAV衣壳(cap)表达质粒库。多样性被引入gydF4y2Ba帽子gydF4y2Ba质粒文库通过插入包含所有可能组合的短DNA序列到一个区域gydF4y2Ba帽子gydF4y2Ba基因。在这个特殊的CREATE中gydF4y2Ba帽子gydF4y2Ba质粒，loxP位点位于下游polyA序列的侧面。当将这个质粒池产生的病毒注射到具有细胞类型特异性Cre的动物体内时，polyA序列仅在表达Cre的组织中被倒置。这种倒置创建了一个适合使用预先设计的引物进行PCR扩增的模板。gydF4y2Ba

通过使用这个文库感染一个在感兴趣的细胞类型中表达Cre的动物，科学家可以从被感染的动物中分离DNA，并使用预先设计的引物来确定衣壳基因的哪个版本成功感染了感兴趣的细胞类型。反复感染和PCR筛选的衣壳变种，可以增加感染感兴趣细胞类型的能力，在Chan等人的情况下，是神经元和星形胶质细胞。gydF4y2Ba

为什么要筛查静脉注射可交付的aav ?gydF4y2Ba

典型的aav是直接注射到大脑，但这往往会限制在注射部位附近的表达。静脉注射到血液中可以让病毒扩散，但它必须能够穿过血脑屏障到达大脑。通过IV筛选能够跨越这个障碍的衣壳，将CREATE AAV文库传递出去——只有那些能够跨越这个障碍的衣壳以后才能通过PCR进行鉴定。PNS提出了一个不同的问题:它扩散到全身，通常很难通过手术治疗。因此，静脉注射是将AAV传送至PNS的理想方法。aav。php。s靶向PNS是一个幸运的意外因为它实际上是被设计来靶向中枢神经系统的。gydF4y2Ba

这些aav转导CNS和PNS的效果如何?gydF4y2Ba

这两种质粒对PNS或CNS的感染都比它们来源于的AAV载体好得多。此外，AAV.PHP.eB的使用剂量低于其母代AAV.PHP.B: 1x10gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba对1 x10gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba每个小鼠的病毒基因组(vg)。图3显示了AAV.PHP.eB和AAV.PHP.S与其亲代载体的总体比较。为了量化这种比较，将GFP转基因包裹衣壳，并测量神经元的GFP强度和转导效率。平均而言，AAV.PHP.eB和AAV.PHP.S的GFP强度是其来源菌株的1.5 ~ 2倍。他们还转导了更多的神经元(GFP+细胞也被染色为神经元标记)。下面的表1和表2对AAV-PHP的量化转导效率进行了总结。eB和AAV-PHP。S和它们的亲代AAV载体。gydF4y2Ba

这些自动驾驶汽车能做什么?gydF4y2Ba

1.神经元的多色标记gydF4y2Ba

神经元的多色标记不仅仅是为了制作漂亮的图片（见图4）。它还支持单细胞解剖学研究和神经元追踪，即确定神经元的轴突和树突延伸到何处。这种方法的关键是1）高度的颜色多样性，使细胞标记有自己独特的颜色；2）低水平的标记，使细胞的投射易于追踪，不会在混杂的荧光神经元中丢失。一种简单但有缺陷的多色标记方法是注入组成性表达红色、绿色或蓝色（RGB）荧光蛋白（4a-c）的AAV载体混合物。当注射高剂量的这种病毒混合物时，许多单个细胞将被多个病毒颗粒转化，并标记各种颜色（图4b）。但请注意，在图4b中，追踪单个细胞的轴突是多么困难，尤其是箭头附近的两个绿色神经元。当使用较低剂量的病毒以减少被标记的神经元数量时，神经元更有可能仅被一种RGB AAV转导，并且表达的主要颜色为红色、绿色或蓝色（图4c）。gydF4y2Ba

表1 AAV-PHP的转导效率。B和AAV-PHP。eB在CNS中。gydF4y2Ba将GFP转基因封装到AAV-PHP中。B或AAV.PHP.eB衣壳。两种病毒均以1x10的剂量静脉注射gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba3周后，通过GFP表达来测定转导水平。表格来源于Chan等人的图2e。gydF4y2Ba

表2:PNS中AAV.9与AAV.PHP.S的转导效率。gydF4y2Ba将转基因GFP封装到AAV.9或AAV.PHP.S衣壳中。两种病毒均以1x10的剂量静脉注射gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba3周后，通过GFP表达来测定转导水平。表格来源于Chan等人的图3b。gydF4y2Ba

为了实现神经元颜色的完全多样性和稀疏标记，Chan等人将颜色标记和颜色表达分离为两部分系统(图4d):gydF4y2Ba

第1部分:gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba由3个表达RGB蛋白的AAV载体在诱导剂控制下的鸡尾酒。gydF4y2Batet-off反式激活因子(tTA)gydF4y2Ba，以高剂量注射，以最大限度地增加被标记的细胞数量。gydF4y2Ba

第2部分:gydF4y2Ba共同注射表达诱导物（即tet-off反式激活因子）的AAV。这种AAV的剂量可以调整，以实现稀疏的标记水平，而不损失颜色多样性。gydF4y2Ba

在这两部分系统中，颜色多样性在tTA诱导剂病毒的高剂量(图4e)和低剂量(图4f)都保持了，但在失去诱导剂病毒的剂量时达到了期望的标记稀疏性。此外，这个系统比gydF4y2Ba大脑彩虹gydF4y2Ba这是另一种用多颜色标记神经元的方法，因为它不需要产生转基因小鼠。gydF4y2Ba

2.CNS和PNS中细胞类型特异性限制性转基因表达gydF4y2Ba

以前,gydF4y2Ba广泛的gydF4y2Ba将转基因导入大脑中的特定细胞类型，你需要制造转基因老鼠。结合AAv.PHP。eB或AAV.PHP。如表1和表2所示，S与细胞类型特异性启动子或增强子的巨大神经元转导效率现在允许在CNS (Chan等人的图5)和PNS (Chan等人的补充图8)中限制细胞类型的表达。这些新型aav可以作为基础科学研究(神经元追踪和形态学研究)的工具，也可以作为翻译应用(神经系统疾病的机制研究和基因治疗)的工具。gydF4y2Ba

Gradinaru实验室有很多工作要做。以下是关键的收获:gydF4y2Ba

1. 用CREATE方法设计了两种新的AAV衣壳(图1)(图2)，使病毒能够有效地IV输送到中枢神经系统或PNS(图32，表1和表2)。gydF4y2Ba
2. 这些衣壳作为两部分荧光标记表达系统的一部分，可以控制诱导神经元的多色标记(图4)，是神经元追踪和形态学研究的有用工具。gydF4y2Ba
3. 这些衣壳可以作为神经元强大的细胞型限制性基因载体，不需要转基因小鼠(见Chan等人的图5和补充图8)。gydF4y2Ba

工具书类gydF4y2Ba

1.陈志强，张俊杰，刘小波，等。设计的AAVs高效无创的基因传递到中枢和外周神经系统。自然神经科学杂志。2017;gydF4y2Ba20 (8)gydF4y2Ba: 1172 - 1179。PubMed PMID:gydF4y2Ba28671695gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

2.等。crea依赖的选择产生AAV变异，用于广泛的基因转移到成人大脑。gydF4y2Ba自然生物技术gydF4y2Ba．2016年,34(2):204 - 209。PubMed PMID:gydF4y2Ba26829320gydF4y2Ba．PubMed Central PMCID:gydF4y2Ba5088052gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

三。Lentz TB，Gray SJ，Samulski RJ。向中枢神188完整比分直播经系统传递基因的病毒载体。gydF4y2Ba疾病的神经生物学gydF4y2Ba．2012年,48(2):179 - 188。PubMed PMID:gydF4y2Ba22001604gydF4y2Ba．PubMed Central PMCID:gydF4y2Ba3293995gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

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