关于你的最好的事情之一通过Addgene共享质粒我们通过质量控制过程对我们分发的质粒提供了更高水平的信心。我们收到的每一个质粒都经过严格的验证，然后才能提供给社区。
然而，在一个每周不断接收大约200个新DNA样本的存储库中，这不是一项小任务。这里我们将介绍我们为验证可用质粒的身份和质量而采取的步骤，并就您可以采取哪些步骤来验证您自己的质粒提供一些建议。
保持条理
随着数百个样本进入我们的大门，确保质粒质量的第一步是保持有序。在Addgene，我们收集通过我们的沉积过程，然后我们使用条形码管板.
给定质粒的关键信息是脊梁骨，插入基因/功能突变，抗生素耐药性，克隆过程中使用的限制性位点，最重要的是，预测的完整质粒序列。其他信息也可能对某些质粒的维护和使用至关重要，如特殊生长说明（温度、菌株、培养基补充）、建议的测序引物或哺乳动物选择标记。
你不需要一个花哨的数据库来组织你自己的质粒收集，尽管你想保留你预测的序列信息的数字拷贝。在活页夹或数字笔记本中收集质粒信息，并确保记下收集的每个质粒的冷冻库位置。使用许多免费提供的DNA编辑软件包中的一个来组装预期的完整质粒序列（示例包括台阶,DNA图谱,串行克隆器和斯纳普金)，并将其保存到共享计算机或服务器。这将确保您实验室的未来成员能够访问和使用他们需要的材料，并避免重复您的工作。另外，如果你选择把你的质粒交给我们，将很容易找到流程所需的所有信息。
始终进行顺序验证
一旦物理样本及其相关信息到达Addgene，我们就可以对质粒进行测序验证。这是确保质量的最重要步骤，因为它将捕获克隆、样本处理或序列组装步骤中发生的任何错误。
我们所有进入的质粒至少被测序两次，有时甚至更多，这取决于我们需要验证的特征的数量。
确定要验证的特征将取决于您正在使用的特定质粒，但是，在大多数情况下，在Addgene，我们会检查我们称之为“插入物”（克隆到质粒中的基因或遗传元素）以及任何其他重要特征，以区分此质粒与其前身。重要特征可能包括克隆连接（大多数序列组装错误发生的地方）、缺失、突变、框内蛋白融合和多个克隆位点。在最简单的情况下，我们有一个带有一个插入的标准主干，并且可以使用普通引物从主干序列到插入序列。如果插入件较大，我们可能只检查5'和3'端，以验证插入件的顺序组件和标识是否正确。在其他情况下，我们处理需要两个以上测序反应的多个插入或内部突变。
在更复杂的情况下，我们有时不得不设计新的引物来对重要特征进行排序。您可以使用底漆设计软件，如Primer3以帮助您设计自定义引物。请记住，在设计测序引物时，引物结合位点和要验证的第一个特征之间需要一些空间，因为测序读取的前50-100个碱基对无法获得可靠的序列数据。你可以期望从一个典型的反应中恢复大约750 bp的干净序列，或者大约250个氨基酸，因此确保你想要验证的特征在这个范围内。
更多信息，请阅读我们的其他博客文章提示序列分析,质粒验证，并使用NCBI爆炸.
高通量质粒测序的技巧
如果你和我们一样，你需要一个并行处理多个测序反应的策略。我们有一些技巧来简化这个过程。
首先，与纯化DNA或菌落测序相反，我们几乎所有的Sanger测序都是从甘油储备（含15%甘油的过夜培养物）中进行的。这意味着我们从存储和分发的完全相同的库存中进行排序。当然，你们的文化应该总是来自一个单一的群体，以确保文化的一致性。直接从甘油原液中测序可以节省纯化DNA的步骤，并提供可比的成功率和序列质量，这对于有效处理大量样本至关重要。
当我们为甘油原料的生产和储存培养过夜时，我们会额外培养一点，并将100µl甘油原料转移到2个96孔微孔板中（相同的拷贝，见上图）。然后，我们借助DNA编辑软件为每个样本选择正向和反向引物，该软件集成了我们2000多个引物的数据库。用引物储备分别制备了两个96孔PCR板，用于正向和反向反应，然后与相应的甘油板一起在干冰上运输至sequencing提供者。
每个测序服务对体积和浓度都有不同的要求，并非所有供应商都能从甘油库存中进行Sanger测序，因此请确保选择合适的服务并阅读提交说明。
至于对大量测序反应的分析，你可以通过选择正确的引物使你的生活更加轻松。如前所述，这通常是从确定质粒之间的不同特征开始的，并选择或设计专门针对该区域的引物。避免在重复区域（如LTR或ITR）、发夹或强终止子内结合或必须读取的引物。在设计引物时，需要考虑其他因素的详细说明。在这里.
最后，您需要一个组织良好的预期序列数据库，无论是插入序列还是完整质粒。这将使您能够根据预期的序列快速爆炸排序结果，以进行快速验证，这可以通过我们的序列分析网络工具. 或者，您可以使用DNA编辑软件对多个序列进行比对，以目视检查同源性和不匹配。
您是否有自己的最佳测序实践，或者关于如何获得更好的测序读数的一些提示？在下面的评论部分告诉我们您最喜欢的排序技巧。
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