腺嘌呤碱基编辑器(ABE)介导A•T-to-G•C碱基的变化(图1)，但使这些碱基发生变化可能具有挑战性，特别是在原代人类细胞中。现在,科学家们梁疗法已经找到了一种改进原始人类细胞编辑的方法(Gaudelli et al.， 2020)。
广泛使用的一种基本编辑ab7.10系统(以及新一代ABEs的起点)由3个部件组成:
- 一种脱氨酶(TadA，最初来源于大肠杆菌,在ab7.10中命名为TadA7.10)
- 催化受损的Cas蛋白(dCas或Cas nickase)
- 一种以TadA和dCas复合物为靶点的导向RNA
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| 图1所示。当ABEs发挥作用时，它们结合DNA，因此TadA结构域可以编辑短的单链DNA片段。从图片高德利等人，2020年． |
定向进化识别腺嘌呤碱基编辑器与改进的细胞系编辑
妮可Gaudelli是，在梁治疗中的基因编辑技术的副主任和基因编辑技术负责人，使用了先前开发的细菌选择策略(Gaudelli et al.， 2017)结合合成的TadA序列库来创建第八代腺嘌呤碱基编辑器，称为ABE8(高德利等人，2020)。生成的abe8需要产生3个同时碱基编辑来抵抗抗生素选择。因此，TadA中的8个突变可以创建所有三种编辑，因此更有效。受这些突变和之前描述的TadA突变(Gaudelli et al.， 2017)的影响，他们相应地修改了ABE7.10，从而产生名为“ABE8”的变体。x”:“8”表示ABE进化的第8轮，“x”为标识进化后TadA域突变的数字占位符。
因为ABE7.10含有野生型TADA和TADA7.10的异二聚体融合，他们设计了一组ABE8（ABE8.X-D）。为了评估从研究人员开发的复杂复杂的野生型坦达的效果：
- ABE8。x-d版本融合了野生型TadA和进化的TadA区域。
- ABE8。x-m版本只包含进化的TadA，比abie8 .x-d小约500个碱基对。
这总共产生了40个新的ABE8变体。当比较这些版本在人类细胞系中的靶上DNA编辑效率时，他们发现了更小的版本，ABE8。x-m显示了与ABE8.x-d相似的编辑行为。总体而言，ABE8s的编辑活动中位数比ABE7.10增加了1.94倍。根据原间隔体的位置，abie8的编辑能力从A5-A7位置的1.5倍到A3-A4和A8-A10位置的3.2倍不等。
研究人员选择了8种已测试的ABE8结构(ABE8.8-m/d, ABE8.13-m/d, ABE8.17-m/d, ABE8.20-m/d)进行进一步评估。
ABE7.10中催化受损的D10A nickase产生的意外插入和删除(indel)可能是一个问题。因此，作者使用催化“死”的ABE8结构S. pyogenesCas9 (dC9-ABE8.x-m / d)。dC9-ABE8。与ABE7.10相比，x-m/d构建物在人细胞系中显示了2.1倍的靶向dna编辑效率，同时将indel频率降低了90%以上。
选择Cas9蛋白增加腺嘌呤碱基编辑器的靶向范围
最常用的S. pyogenesCas9需要在基因组DNA的靶位点包含一个由5 ' -NGG-3 '(“N”可以是任何核苷酸碱基，后面是2个鸟嘌呤)组成的特定原生间隔邻近基序(PAM)。这限制了abe的使用，因为不包含合适PAM的DNA位点不能被有效编辑。为了扩大ABE8的目标范围，团队进行了替换S. pyogenesABE复合物中的Cas9与pam变体Cas9蛋白年代．化脓性链球菌NG- cas9 (PAM: NG)创建NG- abe8。xm / d和年代．葡萄球菌Cas9 (PAM: NNGRRT)创建Sa-ABE8.x-m/d。有了这些变异，ABE8就可以针对基因组中的许多额外位置。与ABE7.10相比，NG-ABE8。xm/d中位数增加1.6倍，Sa-ABE8。x-m/d编辑频率比ABE7.10中位数增加2倍。在ABE8复合物中使用非标准Cas9的能力使碱基编辑的靶向范围更广。
原始人类细胞中的碱基编辑
细胞治疗方法可以使用碱基编辑器来纠正干细胞的突变，并将纠正后的细胞返回给患者。例如，导致镰状细胞病和地中海贫血的血红蛋白(-球蛋白)缺陷可以通过胎儿血红蛋白的表达得到缓解。既往研究表明，即使在成人患者中，γ血红蛋白启动子区(HGB1/2)的一个碱基改变也会导致胎儿血红蛋白的持续表达。为了分析ABE8在初级人类细胞编辑中的临床应用，研究人员在CD34+造血干细胞中测试了ABE8。ABE8有效编辑胎儿血红蛋白启动子，使胎儿血红蛋白持续表达高于ABE7.10。
除了干细胞外，研究人员还使用8个选定的abe8和ABE7.10靶向人类原代T细胞中的6个基因。他们通过测量这六个基因的蛋白质表达减少量来量化基因组编辑。在人类原代T细胞中，所有的abe8都比ABE7.10更有效，其中ABE8.20-m减少蛋白表达最多。
虽然编辑单个基因非常有用，但有时你需要修改多个基因来生成细胞表型。abe8.20米再次夺冠。它可以同时编辑3个基因(分别为98.1%、98.3%、98.6%)，比ABE7.10至少高出1.4倍。abie8.20 -m能够有效编辑初级人类T细胞，使其成为T细胞治疗发展的一个有前途的工具。
在ABE8s中减少脱靶编辑
虽然碱基编辑器是精确的分子工具，但它们确实有不希望的脱靶编辑效果。ABEs已经被描述为在细胞DNA和RNA中引入依赖或不依赖于所用gRNA的碱基变化(Gaudelli et al.， 2017)。作者测试了ABE8.17-m，发现一个碱基变化突变(ABE8.17-m+V106W) (Gaudelli et al.， 2020)能够减少脱靶RNA和grna依赖的DNA编辑，同时保持靶上碱基编辑功能。
碱基编辑器的投放方式起到了脱靶编辑效果的作用。ABEs可以作为质粒或mRNA结构体导入细胞。在原代人细胞中，ABEs的mRNA传递可使靶上编辑更有效，并降低脱靶编辑频率。对于需要高DNA编辑特异性的应用，例如潜在的治疗方法，作者推荐信使rna递送，ABE8的V106W版本，和深思熟虑的guideRNAs选择。特别值得注意的是，本研究中报道的ABE8s并没有引起全基因组、指南无关的脱靶脱氨，而脱靶脱氨是治疗应用的一个重要属性。
ABE8s显示了全面改进的碱基编辑能力，甚至在过去难以瞄准的网站。特别是，它们能够对人类细胞系和原代细胞进行更强大的编辑，这使它们成为基础编辑工具箱中的重要组成部分。
参考
Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR(2017)不进行DNA切割的基因组DNA中A•T到G•C的可编程碱基编辑。自然551:464 - 471。https://doi.org/10.1038/nature24644
Gaudelli NM, Lam DK, Rees HA, Solá-Esteves NM, Barrera LA, Born DA, Edwards A, Gehrke JM, Lee S-J, Liquori AJ, Murray R, Packer MS, Rinaldi C, Slaymaker IM, Yen J, Young LE, Ciaramella G(2020)腺嘌胺碱基编辑器的定向进化，增加活性和治疗应用。自然生物技术。https://doi.org/10.1038/s41587-020-0491-6
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