初级细胞比来自同一细胞类型的永生细胞系更能再现一种感兴趣的细胞类型的自然生物学特性;然而，由于技术问题，它们的使用一直受到限制氨基酸。例如，将感兴趣的基因导入原代细胞要困难得多，所以大多数原代细胞系需要病毒感染。一篇来自尼尔斯·Geijsen的实验室提示原代细胞仅使用蛋白质可能会更好地转导。请继续阅读实验室的描述iTOP蛋白纯转导方法及其在CRISPR/Cas9基因组编辑中的应用前景。
Protein-only转导吗?
Niels Geijsen在乌得勒支的团队想要寻找一种非病毒策略来转导原代细胞。如果它们不提供DNA结构，而只是简单地诱导细胞直接摄取蛋白质呢?这并不是一个新想法，但有几点需要注意。最常见的纯蛋白转导策略是将细胞穿透肽(CPP)融合到感兴趣的蛋白质上，从而赋予其进入细胞的能力。在HIV蛋白Tat中发现了这样一种CPP。虽然CPP融合可以转运细胞膜，但CPP的存在可能改变蛋白质的功能或定位。因此，CPPs的有效性必须根据具体情况进行评估。
在建立CPP系统以研究蛋白质转导的同时，D 'Astolfo et al。令人惊讶的发现，无论是纯化的cppat标记的蛋白，还是未标记的对照，都可以进入培养细胞并激活荧光素酶报告基因的表达。蛋白质进入细胞不需要CPP !在验证了荧光素酶试验的特异性后，他们得出结论，用于蛋白质纯化的缓冲液中的成分一定有助于未标记的蛋白质进入细胞。随后的研究发现，NaCl和非洗涤剂磺基甜菜碱201 (NDSB-201)都是蛋白质转运所必需的。D’astolfo等人创造了iTOP(通过渗透作用和丙甜菜碱诱导转导)来描述这种蛋白质转导方法。后来的研究表明，iTOP通过大胞饮作用发挥作用。
D’astolfo等人在一系列原代细胞类型中测试了iTOP使用Cre和各种loxP记者．在小鼠和人类胚胎干细胞中，他们发现重组率非常高(经过两轮转导后，重组率为78-79%)。与CCP转导相比，iTOP在原代成纤维细胞中的效率至少高出4倍。iTOP还在多种原代小鼠细胞中起作用，包括神经元和肠道干细胞、树突状细胞、胚胎成纤维细胞、胶质细胞和神经元，并且细胞转导后死亡率很低。
CRISPR/Cas9: iTOP的潜在应用
在使用creo -lox重组测试了iTOP后，D’astolfo等人急切地想知道iTOP是否能够兼容CRISPR / Cas9基因组编辑．尽管CRISPR/Cas9非常流行，但他们还有另一个理由来测试这个系统。很难确定iTOP导致细胞吸收多少蛋白质，而持续的蛋白质表达需要多种转导事件。由于这些原因，iTOP最适合于瞬时蛋白表达具有持久效应的二元体系，如Cre-或cas9介导的重组。
经过iTOP处理的初级hESCs和永生细胞都能有效地吸收Cas9蛋白和gRNA(是的，iTOP也可以用于RNA转导)，靶向与白喉毒素致死相关的基因，并被分类成单孔以生成克隆群体。经iTOP处理后，原代(hESCs)和培养的细胞均显示高达70%的白喉毒素耐药性，表明双等位基因突变频率为70%。重要的是，hESCs保留了它们的干细胞性，这表明iTOP可能对CRISPR/Cas9干细胞编辑有价值。
小分子NSDB和Na+高渗是iTOP的关键因素。iTOP可用于转导Cas9和gRNA，随后进入细胞核并切割指定靶点。图改编自D’astolfo等人。
在某些情况下，非病毒转导的潜在好处是很多的。首先，你消除了病毒整合导致基因组其他地方突变和基因表达变化的风险。第二，表达本质上是短暂的，这可能降低核酸酶的毒性或脱靶效应的潜力。第三，蛋白质纯化(一旦制定了方案)可能不像病毒纯化那么费力，而且它不会引起与病毒工作相关的安全问题。第四，直接与蛋白质一起工作消除了病毒载体包装尺寸的限制。188完整比分直播由于这些原因，iTOP，特别是与基因组编辑协同工作，可能会使原代细胞的工作更加高效和可行。
参考文献
原生蛋白的高效胞内递送．D’astolfo DS, Pagliero RJ, Pras A, Karthaus WR, Clevers H, Prasad V, Lebbink RJ, Rehmann H, Geijsen N. Cell. 2015 Apr 23;161(3):674-690。doi: 10.1016 / j.cell.2015.03.028。PubMed．
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先前的蛋白质传递技术:
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