抗体101:ELISA(酶联免疫吸附试验)

抗体被用于许多不同的实验，这些实验要求科学家检测样本中的蛋白质。一种严重依赖抗体的技术是ELISA，意思是Enzyme -l签署了我mmuno年代orbent一个ssay。ELISA用于检测96孔或384孔平板内的蛋白质。酶联免疫吸附法的基本原理是，样品中的任何抗原都能粘附在酶孔上(直接粘附或与覆盖在酶孔底部的抗体结合)，然后通过可视化的酶反应检测其浓度。

类型的ELISA

有四种不同类型的elisa，它们检测抗原的方式不同。它们分别是三明治、竞争性、直接和间接。夹心法和竞争性ELISA采用抗体包覆在孔上从样品中捕获抗原，而在直接和间接ELISA中抗原直接与孔结合。

夹心ELISA

大多数市面上可买到的ELISA试剂盒都是夹层ELISA试剂盒。这项技术的工作原理是首先在平板的孔上涂上一层捕获抗体，该抗体是针对你感兴趣的样品中检测的蛋白质的。当订购ELISA试剂盒时，这些孔通常已经被抗体包覆。然后，把你的样本加入孔中，抗体就会与你感兴趣的蛋白质结合。

下一步是检测蛋白质-抗体对。在夹心ELISA中，这一过程的第一步是添加检测抗体(通常是a单克隆抗体)，也识别相同的目标蛋白质。捕获抗体和检测抗体识别靶蛋白上的不同抗原表位，因此它们之间不会相互竞争。这种抗体还与另一种分子如生物素结合。接下来，将共轭底物加入到孔中。在检测抗体是生物素偶联的情况下，链霉亲和素(对结合生物素有很高的亲和力)，被偶联到辣根过氧化物酶(HRP)。最后，将辣根过氧化物酶(HRP)底物加入到孔中。这个反应产生一个比色反应，反映出每孔中目标蛋白的浓度。加入盐酸后反应停止(详情见下文)。

三明治酶联免疫吸附试验(ELISA)最适合用于检测可识别不同表位的多重抗体的蛋白质;由于使用了多种抗体，这种酶联免疫吸附试验对靶蛋白非常特异和敏感。

图1:使用Sandwich ELISA通过比色反应定量测量蛋白浓度或抗体特异性的概述。从图片Boguszewska等人，2019年．

竞争ELISA

与三明治酶联免疫吸附法类似，竞争酶联免疫吸附法也用于检测混合样品中的单个蛋白。然而，在这种情况下，你感兴趣的蛋白质是预先与已知数量的抗体进行孵育的，抗体可以识别它，而井底是另一种蛋白质——称为参考抗原——也可以与该抗体结合。然后，将蛋白质-抗原混合物加入孔中。任何游离抗体(也就是说它没有与你感兴趣的蛋白质结合)都会与井中竞争的抗原结合，而蛋白质-抗原复合物会在实验过程中被冲走。在井中结合的抗体的数量是原始样本中你感兴趣的蛋白质数量的反比。

竞争性酶联免疫吸附法最适用于检测在夹心酶联免疫吸附法中的两个抗体之间太小而无法捕获的抗原。

虽然最常见的竞争酶联免疫吸附法是三明治酶联免疫吸附法的改进，但直接和间接酶联免疫吸附法(更多细节见下文)也可以适用于竞争形式。

直接ELISA

在直接ELISA中，纯化的蛋白质或实验样本被结合到板孔上，而不是抗体。用纯化的蛋白质包覆孔，可以描述识别该蛋白质的抗体的特性，同时用实验样品包覆孔，可以从样品中检测一个蛋白质。直接ELISA比夹心法或竞争性ELISA步骤少得多，因为感兴趣的蛋白质随后会被酶偶联抗体检测到。接下来，加入它的底物，反应可以通过比色反应显示出来。

当你的抗原只有一种抗体时，通常使用直接ELISA，而其他类型的ELISA需要两种不同的抗体。如上所述，它也可以用来表征针对与平板结合的抗原的抗体。

图3:使用Direct ELISA通过比色反应定量测量蛋白浓度或抗体特异性的概述。从图片Boguszewska等人，2019年．

间接ELISA

除了检测步骤外，间接ELISA与直接ELISA非常相似。类似地，蛋白质抗原被涂在平板的孔上。然而，不是用酶偶联抗体检测你的蛋白质，而是用一-二对。这放大了信号，因为多个二抗可以结合到一个单一的一抗。二抗与酶结合以显示。

间接ELISA与直接ELISA用于类似的实验，唯一的区别是额外的扩增步骤，这有助于可视化低丰度蛋白。

图4:间接ELISA通过比色反应定量测量蛋白浓度或抗体特异性的概述。从图片Boguszewska等人，2019年．

用ELISA检测蛋白浓度

如上所述，测定酶联免疫吸附测定孔中的蛋白质浓度是基于比色反应。最常见的是，这是HRP与底物3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)反应产生的蓝色反应。加入盐酸终止了反应，使溶液变黄。每个孔的吸光度是用酶标仪测量的，它与孔中酶的含量成正比，用来计算你感兴趣的蛋白质的含量。

使用标准曲线

为了进行计算，你需要在实验中加入一条标准曲线。这些是在同一个酶联免疫吸附测定板上的孔，包括你感兴趣的蛋白质的已知浓度。这些孔的光密度(OD)——溶液吸收的光的测量——与已知的蛋白质浓度相对应。重要的是，您需要将标准曲线的一部分绘制成线性方程(还记得y = mx+b吗?)

图5:通过绘制OD值与目标蛋白已知浓度的曲线，可以得到标准曲线。然后沿着这条线绘制出实验样品的OD值来计算蛋白质浓度。从图片Jagarlamudi等人，2015年．

大多数酶标仪能检测到的最大外径是4.0，所以如果你把标准曲线放大到最大值，它就会达到渐近线，你就无法准确地计算出在这个光密度范围内的任何实验井的蛋白质浓度。如果标准曲线没有线性部分或实验样品的OD值达到4.0，可以通过稀释标准曲线、连续稀释实验样品和/或更快地停止酶标- tmb反应来重复实验来解决这个问题。只要确保在计算从OD到蛋白质浓度的过程中加入稀释因子如果你选择的话。一旦确定了标准曲线的线性部分，就可以根据直线方程计算实验井中的蛋白质浓度。

记住这些提示，你就可以在你的实验室里进行酶联免疫吸附试验了!

引用和资源

参考文献

Boguszewska, K.， Szewczuk, M.， Urbaniak, S.等。综述:DNA损伤和不稳定性的免疫检测。细胞。中国科学(d辑):生命科学(2019)。https://doi.org/10.1007/s00018-019-03239-6

Addgene博客上的其他资源188博金宝官网

• 了解使用的优点和缺点单克隆抗体．
• 阅读其他你可以使用抗体的技术抗体介绍后

在Addgene.org上的资源

• 浏览Addgene的质粒抗体集合