抗体101:抗体入门

你可能在新闻或实验室里听到过抗体这个词。但是，到底什么是抗体?作为研究试剂，免疫系统的一个组成部分是如何发挥作用的?让我们来看看!

什么是抗体?

抗体，也被称为免疫球蛋白，是约150 kDa的y型蛋白质，既是免疫系统的自然组成部分，也是一种可以用于各种研究应用的工具。在免疫系统中，抗体由B细胞产生。它们与细胞外病原体(如寄生虫或微生物)表面的蛋白质结合，或与被微生物感染的细胞表面表达的蛋白质结合，从而触发免疫级联反应，清除这些感染。任何在免疫系统中产生抗体反应的东西都被称为抗原。

抗体结合蛋白质的能力对研究应用也很有用，因为它们允许科学家瞄准他们感兴趣的特定蛋白质。一旦一种蛋白质被抗体锁定，你就可以通过荧光或化学发光来观察蛋白质，将蛋白质沉淀出溶液，或分离出表达这种蛋白质的细胞。继续阅读，了解更多关于抗体以及如何在实验室中使用它们!

抗体的组成部分

抗体有两个区域:Fab(抗原结合区)和Fc(可结晶区)。每个抗体分子由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链组成。Fc区域和部分Fab区域由Ig的重链组成，其余Fab区域则由Ig的轻链组成。重链和轻链的可变区域决定了抗体识别和结合的抗原。

图1:抗体标记图，包括Fc、Fab、重链、轻链、恒定区、可变区

重链的恒定区域决定了抗体的同型，即五种抗体(IgM、IgD、IgA、IgG或IgE)中的一种。在免疫系统中，每种同型在免疫反应的不同时间表达，并启动不同的免疫级联反应。在研究中，不同同型的抗体可以在同一个实验中同时使用，因为用于检测抗体存在的试剂部分依赖于其同型。

抗体的可变区不能识别目标蛋白的全部:相反，它只能识别蛋白质的一小部分，即抗原表位。表位长度在5-8个氨基酸之间，典型长度为5或6个氨基酸(Cruse et al.， 2004)。因为蛋白质比这个大得多，它可能包含许多抗体可以识别的表位。想象你正在做一个字谜。你不可能总是一眼就认出整个长长的单词，但你可能会看到几个字母，并能够猜出这串字母是否是你正在搜索的单词的一部分。抗体可以识别线性的氨基酸序列，或者只能识别其三维构象。

抗体的类型和产生

在免疫系统中，抗体是由B细胞产生的。但是，实际上有很多方法可以用于研究，其中一些利用自然免疫系统生产和许多工程方法。每种抗体类型和生产策略都有各自的优缺点。

多克隆抗体

这些抗体来自动物，如兔子或山羊;动物被注射了你想让抗体识别的抗原。这会在动物体内引发免疫反应，它的B细胞会大量产生对抗注射蛋白质的抗体。几周后，从动物身上抽取血液并提取抗体。这些抗体能识别靶蛋白上的各种表位，因此被称为多克隆抗体。由于多克隆抗体可以识别蛋白上的多个表位，因此具有更强的识别目标蛋白的优势。然而，每只动物会产生针对不同蛋白质表位的抗体，因此批次之间的可变性是一个很大的问题。你可以在我们的抗体101:多克隆抗体博客文章。

单克隆抗体

另一方面，单克隆抗体是一种同质的抗体群体，它们都能识别目标蛋白的相同表位。这些抗体通常是由杂交瘤产生的。杂交瘤是将从动物身上提取的B细胞注入骨髓瘤细胞，使其融合而形成的。然后，通过有限稀释的方法亚克隆杂交瘤，产生一个永久的无性系细胞群，产生一种变体抗体。单克隆抗体由于识别目标蛋白的单一表位，不太可能与其他类似的蛋白发生交叉反应。然而，杂交瘤DNA的小突变也会发生，这被称为基因漂移，这意味着随着时间的推移，你期望它产生的抗体不一定是你得到的。了解更多关于单克隆抗体在这里．

重组抗体

与单克隆抗体类似，重组抗体是一个同质的群体。然而，与来自自然产生的免疫球蛋白基因的单克隆抗体不同，重组抗体是基于质粒的。它们的序列可以根据特异性和敏感性进行优化，例如通过改变某些氨基酸来提高其稳定性。此外,向量的选择可以影响抗体的表达水平(Ayyar et al.， 2017)。

单链可变片段(ScFv)

图2:IgG抗体与scFv抗体的比较。

因为抗原结合不需要整个抗体分子，所以可变区可以单独作用作为融合蛋白产生的．一个ScFv是由重链和轻链的可变区域融合在一起形成一个可以识别靶蛋白的单一蛋白(Wang et al.， 2013)。这些蛋白质也是质粒衍生的。然而,一个缺点ScFv与全抗体相比，它们对目标蛋白的亲和力较低(Crivianu-Gaita 2016)。在这篇文章中获得更多关于ScFvs的细节:抗体101:单链片段变量．

纳米体

图3:Hcab与纳米体的比较。

纳米体可变重链片段重链骆驼蛋白抗体(Hcab) (Arbabi-Ghahroudi et al.， 2017)。虽然它们是基于大羊驼的免疫系统，合成nanobodies它可以从质粒中生产，节省时间和金钱。纳米体和合成体对于它们的目标抗原的特异性就像典型抗体一样。它们的优势还在于体积小得多，这意味着它们可以识别完全抗体在物理上无法达到的抗原决定簇。完整抗体为~150 kDa，而纳米体为12-15 kDa。

抗体的研究应用

你可以在很多领域使用抗体进行实验，包括神经科学和免疫学．它们可用于细胞裂解液、全细胞或组织样本中的蛋白表达的定性和定量测量。许多使用抗体的实验使用一种一抗，它识别你感兴趣的蛋白质，另一种二抗，它识别一抗并提供检测方法。你还需要在你的实验中使用适当的控制来解释抗体潜在的非特异性结合。让我们深入了解其中一些应用程序。

免疫印迹

蛋白质印迹法用于检测含有蛋白质混合物的样品中是否存在蛋白质。蛋白质根据分子量通过SDS-PAGE分离，然后转移到膜上。一种识别感兴趣的蛋白质的一抗被加入，并将在膜上与该蛋白质结合。然后，添加一种二抗，使蛋白质可以被化学发光或荧光检测到。Western blot经常用于比较细胞类型或处理条件之间的蛋白表达水平。如果你也在凝胶中加入适当的控制来使蛋白质浓度正常化，它们可以被定量地使用。想了解更多细节，请查看我们的文章Western Blotting的基础知识．

图4:Western blot显示转染了编码GFP的质粒的细胞中GFP的表达。肌动蛋白(Actin)是Western blot常用的内控蛋白，显示每个孔中加入浓度相似的细胞裂解液。从图片Sun等人，2010年．

酶联免疫吸附试验

同样，ELISA也用于检测异质混合物中是否存在单一蛋白，例如，细胞裂解液或培养细胞的培养基。酶联免疫吸附试验可定量测定蛋白含量。反应在96孔板中进行，一抗和二抗用于捕获感兴趣的蛋白质并检测其存在。然后，可以通过每个孔的光量-光密度(OD) -已知和实验孔。

为了找到样本中蛋白质的确切含量，你需要将你的样本与标准曲线进行比较。这条曲线是通过连续稀释已知数量的蛋白质产生的，也用同样的方法检测。由已知样品的OD值和浓度建立的标准曲线用于计算实验样品中蛋白质的浓度。在我们的文章中获得更多关于elisa的细节抗体101:ELISA(酶联免疫吸附试验)．

免疫沉淀反应

有时，你需要从混合物中提取你感兴趣的蛋白质，而不仅仅是检测样品中是否存在蛋白质。抗体也能做到这一点!在这种方法中，抗体与微珠结合，抓住感兴趣的蛋白质，并把它从溶液中拉出来。一旦未结合的蛋白质被冲走，相关蛋白质就会使用低ph缓冲液从珠和抗体中分离出来。纯化后的蛋白可用于Western blot或elisa等一系列样品中蛋白相对含量的比较实验，也可用于其他研究蛋白-蛋白相互作用的实验。

流式细胞术

流式细胞术用于检测整个细胞表面或内部的蛋白质。抗体——通常是一种与荧光团结合的一种抗体，以避免在本实验中使用二种抗体——与细胞混合物一起孵育。使用荧光标记抗体检测蛋白质的技术称为染色技术。这组抗体用于识别细胞从混合物中子集感兴趣的和测量的相对数量上您感兴趣的蛋白质或在这些细胞:抗体可以结合蛋白质在细胞表面,或细胞膜可以permeabilized允许绑定到胞内蛋白的抗体。

荧光信号由流式细胞仪检测，并作为蛋白表达的代理。因为信号来自抗体-荧光团结合物，而不是由细胞本身表达的，所以你可以在每个面板中研究蛋白质，有很大的灵活性。流式细胞术的一个优点是能够使用多种荧光信号(多达十几种或更多!)来测量同一细胞上多种蛋白同时表达的相对或绝对数量，以及样品之间的比较。了解更多关于流式细胞术．

细胞和组织标记

抗体可以用来观察组织(免疫组化)或细胞(免疫细胞化学)。这可能是安装在载玻片上的细胞或组织切片，也可能是整个器官。因为组织结构被保存了下来，这项技术不仅能让你看到特定蛋白质的存在，还能让你看到它们在细胞或组织中的定位。与流式细胞术类似，您将使用抗体对一种或多种特定细胞类型的标记物进行染色，以及对您感兴趣的蛋白质进行染色，以最佳地定位其位置。这些可以用荧光团偶联抗体(即免疫荧光)或酶促比色反应来显示。

图5:银屑病患者皮损皮肤中CD31(绿色)、CARD14(红色)和pNFkB(蓝色)的免疫荧光染色，显示炎症表型。每个蛋白都用未偶联的一抗检测，然后用荧光团偶联的二抗或Fab观察。从图片哈登等人，2014年．

在活的有机体内使用

为了研究和治疗的目的，抗体可以用来影响细胞过程在活的有机体内，这些抗体被称为功能级抗体。一些研究和治疗用途重叠:抗体可以结合和抑制蛋白质的功能，以阻止其在体内的作用，或者它们可以通过结合细胞表面受体来激活细胞通路。这些应用通常用于研究信号通路或开发治疗方法。

实验上，与荧光标记或其他标记物结合的抗体可以注射到动物体内，直接标记循环细胞或其他可以从血液中接触到的细胞。然后，通过抽血或器官采集，可以使用流式细胞仪等技术分析标记的细胞。

结论

唷!现在你知道抗体可以用于很多目的!我希望你能理解有这么多类型的抗体，以及它们可以用于多少不同的研究应用。Addgene的抗体质粒集合包括表达抗体、纳米体和单链抗体的质粒，以及用于开发和生产基于质粒的抗体的工具——我们一直在增加我们的收集!

引用:

Arbabi-Ghahroudi M(2017)驼峰型单域抗体:历史视角和未来展望。Front Immunol 8:。https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01589

Ayyar BV, Arora S, Ravi SS(2017)优化抗体表达:螺母和螺栓。方法116:51 - 62。https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2017.01.009

Crivianu-Gaita V, Thompson M(2016)核酸适配体、抗体scFv和抗体Fab片段:三种最通用的生物传感器生物识别元件的概述和比较。生物传感器与生物电子学85:32-45。https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.04.091

(2004)抗原、免疫原、疫苗与免疫。:免疫学指南。爱思唯尔,pp 17-45。https://doi.org/10.1016/B978-012198382-6/50026-1

Wang R, Xiang S .， Feng Y .， sinivas S .， Zhang Y .， Lin M .， Wang S .(2013)通过共表达分子伴蛋白Skp在大肠杆菌中的工程合成功能单克隆抗体。前细胞感染微生物3:。https://doi.org/10.3389/fcimb.2013.00072

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