抗体101:二抗

如果你一直在关注我们关于抗体的博客文章，那么你可能已经对免疫成像的基础知识有了一个很好的了解。科学家将抗体与信号分子结合，抗体与蛋白质结合，然后瞧!无论你感兴趣的蛋白质在哪里，信号也会出现。这是免疫成像分析的直接方法。但是，如果直接的方法没有给你足够的信号来检测你感兴趣的蛋白质，可能是时候考虑间接的方法了——这意味着是时候讨论二级抗体了。

一抗与感兴趣的蛋白结合，二抗与一抗结合。在间接方法中，信号分子被偶联到二抗而不是一抗上。由于多个二抗可以与一个一抗结合，这种方法可以通过增加与每个感兴趣蛋白间接相关的信号分子的数量，大大提高检测的敏感性。

二级抗体如何工作？

二级抗体是来自特定物种的抗体同种型产生的抗体，例如兔IgG类抗体。它们通过靶向抗体的FC区域，所谓的“常数”区域，这是非常有用的，包括跨越和独特的物种。该Fc区（抗体Y的茎）足够大以允许多个二抗结合到一抗体而不干扰高变区域，其中抗体结合其靶标。虽然大多数二级抗体识别宽的同种型类，但是可以获得针对同种型亚类的二次抗体，例如小鼠IgG2或IgG4。这对某些应用程序很重要。

分析使用

虽然二级抗体是有用的信号放大器，但它们使用的灵活性在应用中变化。例如，蛋白质印迹几乎总是使用间接方法，而流式细胞仪的标准方法是直接方法。ELISAS，免疫组织化学和免疫细胞化学可能都可以使用直接方法或间接方法，这取决于具体测定的要求。对于后三个，当感兴趣的蛋白质以低量或共轭信号分子具有弱信号时，表明二次抗体。对于流式细胞术，可以在发生其他信号放大技术之后，每次可以指示二次抗体。

易于访问

信号扩增不是二抗体的唯一好处。寻找右上抗体的测定和感兴趣的蛋白质通常是任何免疫瘤测定最具挑战性的组分之一。另一方面，二级抗体易于来源，并且容易获得与许多不同的信号分子缀合的可用。通过直接方法，原发性抗体必须是已经在实验室中缀合或缀合的生物抗体。在间接方法中，您可以只需用手存放缀合的二抗，并使用它们来容易地测试不同的抗体或不同的信号分子。许多实验室发现，在开发测定时，次级抗体的可信量储存了时间和金钱。

协议体系结构

间接方法的基本（非常基本的！）架构如下：

1. 准备样品。
2. 用初级（未缀合）抗体孵育样品。
3. 进行一系列的洗涤步骤，去除任何未结合或多余的抗体。
4. 再次用缀合的二抗孵育样品，其将与一抗抗体结合。
5. 执行第二系列洗涤步骤。
6. 激活信号分子并执行检测读数。

当然，说起来容易做起来难!每种技术，有时是每种单独的检测方法，都需要对样品、抗体、激活和检测读数进行开发和优化。你会注意到二级抗体需要自己的孵育和清洗步骤，这意味着间接方法通常比直接方法要长得多。

尽管二抗的孵育时间往往比一抗短，但由于结合亲和力的增加，许多间接抗体协议被设计成在多天内进行。增加运行时间被认为是间接方法的主要缺点之一，它延长了通常已经很长的过程。(虽然我有可靠的证据表明，一个完整的西方印迹可以在一天内完成，但我真的不能推荐它，除非是在最可怕的情况下。)

多路检测

莫'蛋白，Mo'问题可能不是一个常见的谚语，但它可能应该是。在多重测定中 - 一个具有感兴趣的多种蛋白质 - 二级抗体在选择前需要仔细考虑。例如，如果所使用的所有主要抗体是小鼠IgG抗体，例如，抗小鼠次级将不分青红皂白地与所有主要抗体结合，给出相同的输出信号。在这些情况下，最好在可能的情况下使用直接方法，或者确保原代抗体是不同的物种和/或同种型。对于高度复用的测定，使用识别初级抗体的特异性同种型亚类的二级抗体可以增加靶蛋白的可能数量。

这个规则的例外是Western印迹。该基于凝胶的方法而不是使用信号分子来鉴定每种感兴趣的蛋白质，而不是用重量和尺寸识别蛋白质，依赖于信号分子，仅呈现出可视化的asmeans。这意味着，如果所有初级抗体是来自相同物种的相同同种型，则无论蛋白质靶数的数量如何，都需要一个二次抗体，简化多重测定。

简要说明

由于间接方法依赖于多个二级抗体附着在一个单一的一抗上，有时假设直接方法比间接方法更定量。但在现实中，多重一抗能够并且确实附着在一个单一的靶蛋白上，所以这个假设是不正确的。除流式细胞术外，大多数免疫成像分析方法不允许对样品进行绝对定量分析。相反，相对定量可以用直接或间接方法来完成。

新方法

在实验室中，时间是一种宝贵的商品，消除对二次抗体的需求将节省大量时间。研究人员不断地寻找方法来改进直接的方法，避免间接的方法。例如，一些Western blotting使用用探针标记的一抗，从而消除了二抗的需要。其他的免疫组织化学进展已经发现了增加偶联一抗信号的方法。抗体片段的引入，如nanobodies，推出了增加信号强度的新选项。

然而，暂时，二次抗体仍然是信号放大的去选择，同时提供测定发育中所需的灵活性。理解如何以及为什么使用二级抗体的研究人员将发现自己能够更加自信地接近免疫分析测定，收集更广泛的数据，偶尔问自己和其他人最令人困惑的问题：“谁搬到了山羊抗兔子？！“*

*山羊体内产生的对抗兔子免疫球蛋白的二抗。

引用和资源

更多资源请访问Addgene的博客

• 抗体101：免疫荧光引入
• 抗体101：ELISAS
• 抗体101:抗体概论

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