当你想到抗体时，你可能会想到单克隆抗体(mAbs)。由于获得诺贝尔奖的工作，mab自1975年以来一直存在Milstein和科勒谁开发了杂交瘤技术。但是单链片段变量（scfv）呢？scfv在1988年由两个独立的实验室克隆时，已经十年没有开发了(伯德等人，1988年；Huston等人，1988年).单链抗体是能够结合抗原的抗体分子的最小单位。虽然它们可能看起来不太熟悉，但单链抗体通常是构建工程蛋白质的基础。让我们来了解一下单链抗体。
什么是scFv?
单链抗体是一种重组抗体，是约25kDa的单链多肽，含有单链抗体的可变轻链（VL）和可变重链（VH）抗体这两条链由一个柔性连接肽连接，通常15-20个氨基酸长，由甘氨酸和丝氨酸组成与分散的亲水残留物增加溶解度(Monnier et al.， 2013)。连接器使一个可变结构域的c端和另一个结构域的n端保持一定的距离，有利于抗原结合位点的正确折叠和形成，同时也能最大限度地减少scFv的齐聚。虽然你可能认为单链抗体的可变结构域与抗体(vl - linked - vh)相似，但vl - linked - vh和vh - linked - vl构型都可以产生功能性单链抗体;然而,某些单链抗体在一种配置中的性能优于另一种配置(Sandomenico等人，2020年)。
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| 图1:IgG抗体与scFv抗体的比较。 |
单链抗体与单克隆抗体的优缺点是什么？
scFvs的优点:
scFv的优势在于其规模。由于单克隆抗体可以在细菌中表达，所以单克隆抗体的体积更小意味着制造单克隆抗体更容易、成本更低，而单克隆抗体通常需要哺乳动物的表达系统。scFvs也足够小，可以进行筛选体外显示方法例如噬菌体展示（Bradbury等人，2011年）。体外选择避免了动物免疫，也允许产生针对两种抗原的单链抗体，这两种抗原不可能产生单链抗体体内：体内发现的抗原或自身抗原，以及对动物致命的毒素。
在临床上，单链抗体的大小也比抗体具有优势(Ahmed等人，2012年，贝茨电力公司，2019年)：快速血液清除，有助于成像应用；更好的组织渗透，有助于治疗和成像应用；给药时降低免疫原性体内因为他们没有Fc区域．
单链抗体的缺点：
与抗体相比，单链抗体往往具有较低的亲和力、较低的长期稳定性，并且由于其较小的尺寸而具有较高的聚集可能性(贝茨电力公司，2019年)。它们从血液中快速清除可能是治疗应用的一个缺点，因为较长的保留时间通常会提高治疗效果(Ahmed等人，2012年)．
如何生成单链抗体？
单链抗体序列传统上是通过扩增病毒的VLAN和VH抗体序列来克隆的杂交瘤但是噬菌体展示是产生单链抗体的一种流行方法。
对于噬菌体展示，单链抗体的汇集文库展示在噬菌体的外壳上，这是一个连接基因型和表型的过程。将噬菌体展示文库与平板结合抗原一起培养有助于选择高亲和力的单链抗体。然后，通过感染细菌进行额外的淘洗和单链抗体表征，使结合的噬菌体增殖N
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| 图2：噬菌体展示从展示在噬菌体外壳上的单链抗体库开始。该文库与平板结合抗原孵育，以选择具有高亲和力结合的单链抗体。结合的噬菌体然后通过感染细菌增殖，以进行额外的筛选。使用Biorender.com创建。 |
一些噬菌体展示文库从免疫动物的B细胞中筛选抗体基因，但可以通过使用半合成或完全合成的VL和VH序列来避免动物使用。噬菌体展示还允许从患病或接种的人类的B细胞抗体基因中筛选单链抗体。
你们如何生产单链抗体？
虽然可以在哺乳动物、酵母、植物和昆虫细胞中产生单链抗体，但它们通常是通过细菌中的质粒表达的(Ahmed等人，2012年)细菌表达的一个挑战是在VL和VH结构域之间正确形成二硫键。这种键为单链抗体提供稳定性和溶解性(Gaciarz和Ruddock，2017年)，但需要氧化环境才能形成。当在细菌的非氧化细胞质中表达时，scFvs在不溶性包涵体中积累。虽然可以从包涵体中重新溶解和重新折叠scFvs，但这是费时费力的。
为了避免这种情况，这些方法中的一种或多种通常用于在细菌中表达单链抗体：
- 靶向细菌的氧化性周质，以允许适当的二硫键形成。
- 在氧化还原突变的细菌菌株中表达，因此它们的细胞质更具氧化性。
- 有助于单链抗体在细胞质中正确折叠的分子伴侣存在时的表达(Sandomenico等人，2020年)．
- 转换为半胱氨酸自由格式更容易在细胞质中表达大肠杆菌，尽管这不可能适用于所有单链抗体。
scFvs的用途是什么?
单链抗体有很多用途。scFvs甚至被用来筛查新的抗体。为此，将抗体可变结构域序列表达为scFvs并进行筛选体外分析以选择强结合。然后将所选单链抗体的可变结构域序列插入编码抗体恒定结构域支架的载体中，以将单链抗体转化为抗体。
单链抗体与其他蛋白质结构域结合的能力，就像乐高积木一样，使它们比抗体更适合用作工程蛋白质的构建块。这种灵活性主要是由于单链抗体比抗体小。单链抗体通常在基因上与其他蛋白质融合，这导致了它们在基础和翻译研究中的应用。
单链抗体的基础研究应用：
- 的桑塔格该系统使用单链抗体来放大标记蛋白的荧光强度。SunTag有两个组成部分:1)一种有趣的蛋白质，它被标记有10-24个短表位GCN4副本，也被称为支架;2)与GFP融合的GCN4结合scFv。当scFv-GFP融合的多个拷贝与SunTag支架结合时，荧光信号的强度被提高，使活细胞中的单分子跟踪成为可能。
- 的HA frankenbody是一种HA标记检测探针。它包含一种HA结合单链抗体，该单链抗体与荧光蛋白（如GFP）融合。HA frankenbody的工作原理与抗体探针类似，但由于其是基因编码的，因此更容易生成，成本更低。
scFvs的翻译应用:
- 就像抗体一样，在临床试验中或已经在临床上有许多基于单链抗体的疗法(贝茨电力公司，2019年)．许多专为肿瘤应用设计的scFvs被重组为结合CD3和肿瘤特异性抗原的双特异性分子。当这些被称为双特异性T细胞接合子(BiTE®s)的分子结合T细胞和肿瘤特异性抗原上的CD3时，它将T细胞带到肿瘤部位。ScFvs还可以与细胞毒素、放射性同位素、细胞因子和用于癌症、自身免疫和/或炎症治疗的酶融合。抗体片段(如scFvs)也被用于治疗眼病，如年龄相关性黄斑变性(AMD)，因为向眼睛定向注射可使眼睛内药物浓度高而全身副作用极小。
- 单链抗体是工程抗体的一部分嵌合抗原受体(CARs)。CARs是单链抗体和T细胞受体的嵌合体，在T细胞上表达以形成CAR T细胞。受体的细胞外单链抗体部分识别感兴趣的抗原，而CAR的细胞内T细胞受体部分促进信号转导和T细胞释放细胞毒颗粒。当CAR具有单链抗体时，That结合癌相关抗原，结合受体的单链抗体部分可以激活T细胞杀死癌细胞。
- scFv的小体积也使得它们可以通过像AAV这样的病毒载体传递，这可能对传递有用188完整比分直播抑制HIV的scFvs。
引用和资源
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