避免荧光蛋白与mOX FPs融合的阴暗面

本文由客座博主Erik L. Snapp和Lindsey M. Costantini贡献。

“你低估了黑暗面的力量。”

——达斯·维德，《绝地归来》

而维德指的是神秘的力这句话同样适用于许多显微镜实验金宝搏app下载(FPs)定位于细胞质以外的室段。也就是说，不幸的是，一些研究人员太晚意识到，他们已经错过了黑暗，非荧光和错误折叠fp融合对定量成像实验和细胞生理的影响。

荧光蛋白融合的缺陷

在用你最喜欢的蛋白质克隆FP融合后，第一次观察到一个明亮的信号是令人兴奋和有益的。但是，如果FP与常驻内质网(ER)蛋白的融合定位于细胞质会怎样呢?或者更麻烦的是，如果大部分融合蛋白分子不能正确折叠怎么办?错误折叠的FPs不会发出荧光。暗色细胞不明显，会干扰定量成像实验，甚至对细胞产生负面影响(见图1)。

当行为适当时，FPs使研究人员能够研究荧光蛋白融合在活细胞中的定位和动态在真正的时间．之前，我们已经描述了在决定将FP放置在融合构造中的位置时应该考虑的一些实际考虑因素[1，2，即FP序列相对于细胞室靶向序列的定位，后者往往有绝对的定位要求。例如，KDEL ER检索序列仅在c端极端处起作用[3.］.因此，你必须决定你的克隆策略然后根据你的实验需要决定你是要制造N端聚变还是c端聚变。

同样重要的是，在克隆之前，你必须考虑你的FP是否以及如何在它将要定位的环境中发挥作用[4］.大多数研究者惊讶地发现FPs通常不适合细胞室而不是细胞质。一般来说，FPs是在细胞质环境中进化或被设计用于细胞质环境的。然而，大约40%的人类(和大多数真核生物)蛋白质定位于化学上的不同亚细胞的环境，包括组成分泌途径的细胞器、内吞囊泡、线粒体、溶酶体或它们被分泌到细胞外环境。这些区域内的许多蛋白质都经历了重要的翻译后修饰，包括糖基化、二硫键形成和蛋白水解裂解。本地化到细胞器的FPs同样容易受到这些非原生修改的影响，这些修改都可能影响功能[5］.我们和其他人报道了FP半胱氨酸残基在分泌途径中形成不适当的二硫键(图1)[4，6- - - - - -8］.此外，编码n -糖基化共识序列的FPs通过添加n -糖聚糖修饰[9］.这两种翻译后修饰都可以破坏FP折叠，使蛋白质变得非荧光。

不幸的是，累积的错误折叠和无功能(暗)荧光蛋白不能被忽略。金宝搏app下载它们有可能干扰常驻ER伴侣的功能，并可能影响细胞功能或生存能力。FP的错误折叠甚至可以破坏融合蛋白的定位。例如，FPs之间不适当的链间二硫键的形成阻碍了高尔基复合物定位的融合正确退出ER和荧光(见图2)[5］.当使用含有两个半胱氨酸残基和一个旨在将其定位到分泌途径的序列的FPs时，可以用免疫荧光检测到错误定位到ER的暗池。这类暗融合可能是错误折叠，通过分泌途径受阻，并保留在内质网。

不可否认，FPs已经成为强大和成功的工具，使许多细胞生物学分析成为可能。然而，有一种普遍的观点认为，细胞中的大多数FPs都会折叠，荧光模式相当于fp -融合蛋白的分布。我们的研究和其他人的研究(5，6，7，10，11)突出了错误折叠深色FP融合的真实后果，包括融合蛋白水平的错误定量。目前尚不清楚FP的错误折叠是否影响融合蛋白的功能，这可能导致对融合蛋白活性的低估或高估。我们鼓励研究人员对fp融合蛋白的功能特征与感兴趣的未标记蛋白相关。为避免暗荧光蛋白在您的实验中积累，请考虑以下几点:金宝搏app下载

如何确保FP与非胞质蛋白的融合正常运作?

我们建议从新出版的开始氧化优化的FPs调色板(moxFPs)［5］.moxFPs克服了常用荧光蛋白的固有问题，通过改变常用荧光蛋白的半胱氨酸残基和n -糖基化共识序列进行重组金宝搏app下载。这就产生了一种惰性绿色，青色，黄色的,蓝色的变体可以在各种组合中使用。例如，使用标准的荧光显微镜滤镜组，用户可以用绿色和蓝色或青色和黄色moxFPs的组合标记多个感兴趣的蛋白质。moxFPs的固有亮度和光谱特性与未优化的亲本蛋白相当。我们最近的出版物说明当使用优化的moxFP而不是标准FPs时，荧光信号的定量增加。信号的增加不是由于更亮的FP，而是由于大多数(如果不是全部的话)FP融合的正确折叠和荧光团形成。

我们的moxFPs目前是在各种细胞室中成像的最惰性的解决方案之一，包括分泌途径(图2)、线粒体和叶绿体的内膜空间、细胞外环境和革兰氏阴性细菌胞浆周质。标签的努力利用CRISPR对这些区域内蛋白质的内源性基因进行分析基于上述原因，系统应该考虑使用moxFPs而不是标准FPs。此外，由于moxFPs是高度单体化的，它们是与整体膜蛋白和膜相关蛋白(即GPI-anchored蛋白)融合的极佳选择，这些蛋白更容易受到许多标准FPs的齐聚效应。moxFPs现在可以通过Addgene获得

非常感谢我们的客座博主Erik L. Snapp和Lindsey M. Costantini!

Erik Lee Snapp获得俄勒冈健康科学大学分子微生物学和免疫学博士学位，他和美国国立卫生研究院的Jennifer Lippincott-Schwartz一起做了博士后研究，目前他是阿尔伯特·爱因斯坦医学院解剖学和结构生物学系的副教授。他的兴趣包括内质网分泌蛋白的质量控制和活细胞成像方法。埃里克也是一个狂热的长跑运动员，加德纳和库克。

Lindsey M. Costantini在阿尔伯特·爱因斯坦医学院获得生物医学研究博士学位。她的博士研究是在Erik Lee Snapp实验室进行的，专注于优化亚细胞环境的荧光蛋白。金宝搏app下载目前，她是北卡罗莱纳大学教堂山分校的SPIRE博士后研究员。在Blossom Damania和Jack Griffith的共同指导下，她的研究重点是卡波西肉瘤相关疱疹病毒的复制机制。

参考文献

1.Snapp,埃里克。细胞生物学中荧光融合蛋白的设计和使用细胞生物学的当前协议(2005): 21。PubmedPMID: 18228466．公共医学中心PMCID:PMC2875081．

2.Snapp,埃里克·李。"金宝搏app下载荧光蛋白:细胞生物学家的用户指南"细胞生物学趋势19.11(2009): 649 - 655。PubmedPMID:19819147．公共医学中心PMCID:PMC2784028．

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4.科斯坦蒂尼，林赛·M和埃里克·李·斯纳普。细金宝搏app下载胞器中的荧光蛋白:严重的缺陷和一些解决方案DNA与细胞生物学32.11(2013): 622 - 627。PubmedPMID:23971632．公共医学中心PMCID:PMC3806368．

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