回到细菌:利用trna的CRISPR gRNA复用

在其发展的短短时间内,，CRISPR / Cas9基因组编辑已被用于研究体内和体外基因敲除的效果，以及通过同源重组插入靶向突变。为了进一步提高CRISPR/Cas9的效用，有必要提高其复用能力. 由于生物通路的自然冗余，多路复用是关键；为了观察一种表型，常常需要对多个基因进行修饰。

Guide RNAs (gRNAs)通常包装在400-500 bp的盒中，包含RNA pol III启动子、gRNA和pol III终止子。这些相对较大的盒子(考虑到gRNA本身大约有100个碱基)限制了可以打包在单个载体中的gRNA的数量。此外，pol III启动子较弱，这些构建物的gRNAs低表达会降低基因组编辑效率。

以前的一项战略多路复用RNA使用RNA核酸酶Csy4从铜绿假单胞菌从一个多顺反子转录本上切割4个由28个碱基Csy4识别位点分开的gRNAs。虽然这种方法缩短了构建的大小，但它需要Csy4与Cas9和多顺反子转录本共表达。由于核酸酶可能具有脱靶作用和/或毒性，因此使用一种预先存在的、保守的细胞机制来处理grna将是有利的。

劫持tRNA处理以生成gRNAs

在最近发表的一篇论文中，杨益农集团这是他们在水稻种植中CRISPR工作的一部分。杨对几乎存在于所有生物中的tRNA加工机制很感兴趣。在真核生物中（细菌中为E），前体或前tRNA被核糖核酸酶P和Z切割，只有少数tRNA元素是识别和切割所必需的。这种序列的灵活性表明，在不影响切割效率的情况下，gRNAs可以整合到这些结构中。此外，tRNA包含增强pol III转录的内部转录元件，可能增加gRNA表达水平。由于tRNA是细胞中最丰富的分子之一，该系统显然也足够强大，以确保高水平的gRNA切割。

Xie等人以tRNA-gRNA和tRNA-gRNA-tRNA的形式构建了多顺反子甘氨酸tRNA-gRNA基因（PTG），在gRNA之前具有短5'间隔序列，以测试gRNA的切割。gRNAs被精确切割，正如预测的那样，没有向5'间隔区添加核苷酸。在tRNA-gRNA构建体中，用1-7碱基聚（U）尾或tRNA-gRNA-tRNA构建体中第二个tRNA的1-4碱基尾对3'端进行轻微修饰。具有任何5'前导核苷酸的gRNAs都可以被加工，这与其他有利于5'末端某些核苷酸的方法相比具有明显的优势。

PTG构造示意图。剪刀表示劈开部位。

在确认gRNA切割后，他们检测了水稻原生质体中两种PTG结构的gRNA表达水平和indel生成。与匹配的传统gRNA表达结构相比，PTG1和PTG2的转录水平分别高出3倍和31倍。在水稻原生质体中，Xie等人观察到的突变率比以前在原生质体中报告的略高（目标位点的15%和9%）

Cas9能修改多少个基因座?

为了测试该系统在gRNA复用中的应用，Xie等人再次利用水稻原生质体构建了含有8个针对4个MAPK基因的gRNA的PTG。每对GRNA都以350-750 bp的基因组位点为靶点，允许它们检测每个位点的两个INDEL的频率以及大的缺失。他们检测到四个基因座的片段缺失频率为4-20%，表明Cas9至少可以被引导到8个不同的基因座。

他们还检测了完整水稻植株的编辑效率，将传统gRNA结构与PTGs进行了比较。在包含两个gRNA的PTG结构中，他们发现两个靶点上的indel频率均为100%(双等位基因分别为35%和76%)，而使用标准单一gRNA结构时，indel频率仅为44%和66%。当测试含有5种grna的PTG结构时，他们发现50%的植物在所有5个位点上都有双等位基因突变。这种高效的多路复用进一步说明了PTGs的潜力。

发现的应用

PTG系统的主要优点是它的通用性;在原核生物和真核生物中，tRNA处理是普遍存在的。虽然Xie等人制作的质粒是专为植物表达而设计的，但PTGs可能适用于许多不同的生物系统。虽然Xie等人在植物中描述了该系统，但PTGs可能在许多不同的生物系统中发挥良好的作用。规模也是一个因素;pol lll启动子和终止子只需编码一次，每个<200 bp的tRNA-gRNA占标准pol III-gRNA的一半空间，这将有助于在包装容量有限的系统中CRISPR/Cas9的多路复用。

还对各种tRNA表达策略感到困惑吗？不用担心，我已经在下图中总结了这篇文章中描述的三种策略——包括一些简单的比较。

PTGs提供的简单多路复用将提高CRISPR/Cas9在新的研究领域的效用。使用多个grna靶向单个基因可以增加基因敲除的可能性，或者多个grna可能被用于靶向具有重叠活性的基因。多个gRNAs也可以促进其他区域的缺失，如非编码rna或调控元件，以检查其功能。细菌和病毒展示了多顺反子基因组织的力量，其翻译成CRISPR/Cas9显示了多路基因组编辑的巨大潜力。

有兴趣在你的研究中使用PTG质粒吗?检查可从Addgene获得的PTG质粒或植物表达系统．如果你对这项技术有任何问题或想法，请在下面的评论中留下。

参考文献

• 利用内源性tRNA处理系统增强CRISPR/Cas9多重编辑能力。谢克，明肯伯格B，杨Y.美国国家科学院学报，2015年3月17日；112(11):3570-5. 内政部：10.1073/pnas.1420294112。Epub 2015年3月2日。PubMed．
  
  
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gRNA多路复用的其他技术

• 利用整合的RNA和CRISPR/Cas工具箱在人类细胞中对基因网络进行多路可编程调控。Nissim L, Perli SD, Fridkin A, Perez-Pinera P, Lu TK。中国海洋大学学报(自然科学版)。2014年5月22日;doi: 10.1016 / j.molcel.2014.04.022。2014年5月15日。PubMed．
  
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• 用于高度特异性基因组编辑的二聚体CRISPR RNA引导FokI核酸酶。Tsai SQ、Wyvekens N、Khayter C、Foden JA、Thapar V、Reyon D、Goodwin MJ、Aryee MJ、Joung JK。纳特生物技术公司。2014年6月；32(6):569-76. 内政部：10.1038/nbt.2908。Epub 2014年4月25日。PubMed．
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