四名基地编辑记者实时监控和丰富编辑

碱基编辑器可以在基因组中产生特定的点突变，但与传统方法相比，它们效率低下CRISPR/Cas9依赖于双链DNA断裂的编辑。由于这种效率低下，对科学家来说至关重要的是不仅要容易识别基本编辑在他们的实验中，事件是实时的，但对碱基编辑的细胞也很丰富。在过去的几年里，科学家们创造了一系列的基础编辑记者，他们可以帮助你做到这一点。

实时监测APOBEC和Cas9介导的编辑

这个哈里斯实验室创建王牌，负责监控的记者APOBEC（胞苷脱氨酶蛋白家族）和Cas9介导的编辑实时(St. Martin等人，2018年)。ACE报告基因是一个双反子结构，由一个突变的mCherry和一个下游组成活性的eGFP组成。为了创造不活跃的mCherry，实验室引入了43个碱基对的插入，由于帧移干扰了荧光。只有通过apoec - cas9n - ugi复合物的编辑才能恢复荧光。那么这到底是如何工作的呢?

图1:APOBEC和cas9介导的编辑(ACE)报告。从图片圣马丁等人，2018年.

APOBEC-Cas9n-UGI靶向43碱基对mCherry插入中发现的首选三核苷酸基序（5'-TCA至TUA）。编辑这些基序会产生病变，病变会被典型的碱基切除修复酶切除和单链DNA切割。同时，Cas9n切割相反的DNA菌株，产生两个DSB，可通过NHEJ修复mCherry表达来修复。然后可以使用荧光激活细胞分类（FACS）对细胞进行分类，通过比较仅表达eGFP的细胞与表达eGFP和McHery的细胞，可以轻松确定编辑效率。ACE用于识别已成功使用APOBEC3A和APOBEC3B编辑的细胞（St.Martin等人，2018）。

TLDR:来自哈里斯实验室的ACE报告人员依靠恢复mCherry的帧移来恢复荧光，以监测apoec - cas -9介导的编辑。

APOBEC-Cas9用于单碱基编辑的eGFP报告器

尽管ACE报告实时量化了apoec - cas9的效率，但它依赖于dsb，对于监测单个碱基编辑并不理想(St. Martin et al.， 2018)。

为了避免测序和对DSB的需求，哈里斯实验室创建了一个小组eGFP记者量化靶上DNA编辑效率(St. Martin et al.， 2019)。为了创造eGFP报告器，哈里斯实验室分别对eGFP中的三个密码子进行突变以消除荧光。这创造了三个灭活eGFP报告者—eGFP L202、eGFP L138、eGFP L93。

将修饰后的eGFPs置于野生型mCherry和T2A位点下游，并在细胞中表达。mCherry是组成表达，以识别成功转染的细胞。apobeccas9编辑体的C-to-T编辑可以恢复eGFP荧光，通过将eGFP和mCherry阳性细胞的数量除以仅mCherry阳性细胞的数量，可以轻松量化单个碱基的编辑效率(Martin et al.， 2019)。

图2:使用基本编辑记者进行编辑的效率。从图片圣马丁等人，2019年.

Harris实验室使用这些eGFP报告分析了7种人类APOBEC3蛋白的碱基编辑能力，发现APOBEC3A和APOBEC3bctd是最有效的(Martin等人，2019)。

TLDR：来自哈里斯实验室的eGFP报告者避免了DSB在监测APOBEC-Cas9编辑体复合物的靶DNA编辑效率方面的需要。eGFP报告者依赖于eGFP点突变的校正，从而恢复荧光。

编辑浓缩的瞬态报告器(TREE)

这个王布拉夫曼实验室开发了短暂的记者编辑充实(树)纯化单个碱基编辑细胞无需单细胞分离和下游测序（Standage Beier等人，2019年）。TREE是一种基于荧光的实时识别系统，用于分离基础编辑细胞群。

为了开发这种方法，实验室受到了使用了集成的GFP报告，转换成BFP(蓝色荧光蛋白)对CRISPR/Cas9同源性定向修复(HDR) (Glasser et al.， 2016)。对于TREE，他们设计了一种BFP变体，在被胞苷脱氨酶碱基DNA编辑器定位后，该变体会转化为GFP。特别是BFP突变体(BFPH66)在氨基酸66处含有组氨酸。这个组氨酸是由一个' CAC '密码子编码的，在一个C-to-T碱基编辑事件后，这个密码子被转换为' TAC '或' TAT '。这个编辑将组氨酸改变为酪氨酸，产生GFP变体(GFPY66)，具有转移的发射光谱。如果碱基编辑成功，则会产生GFP荧光，可以通过流式细胞术进行可视化和分类。

图3：用胞苷脱氨酶碱基编辑器靶向pEF-BFP导致发射光谱从BFP向GFP转移。来自Standage Beier等人，2019年.

该团队通过用BFP变体、BE4am-Cas9碱基编辑器和sgRNA载体感染HEK-293细胞对TREE进行了测试，以使BFP转化为gfp，并瞄准基因组中感兴趣的特定位点。Wang和Brafman实验室显示，与仅通过转染报告器分离的细胞相比，用TREE分离的GFP阳性细胞的感兴趣的基因组碱基对编辑频率明显更高，后者仅报告质粒传递到细胞的效率。相比之下，TREE为质粒传递和随后的碱基编辑效率提供了读取。

TLDR: Wang和Brafman实验室的TREE使用了一种工程BFP变体，在碱基编辑事件后转换为GFP。与单独转染的细胞相比，GFP阳性细胞可以被分类，其感兴趣的碱基编辑频率明显更高。

“基因开启”（GO）-一个功能报告系统，用于识别和丰富基础编辑活动

以上提到的记者都依赖于GFP荧光和使用FAC的细胞分类，这可能会限制它们在不同细胞类型和系统中的使用。

为了引入灵活性陶氏化学实验室创建了一个基地编辑记者d检测并丰富活体内的基础编辑事件，而不完全依赖GFP（Katti等人，2020年）。他们给这位记者起名“基因开启”还是继续. GO通过影响不同报告蛋白的蛋白质翻译而起作用。蛋白质翻译需要紧靠kozak序列下游的AUG起始密码子。陶氏实验室假设，如果他们使用碱基编辑器（C>T转换）从ACG密码子创建ATG密码子，他们可以诱导任何可检测蛋白质的翻译，而不仅仅是荧光蛋白质。金宝搏app下载

图4:Gene On中的报告者包括mScarlet报告者、荧光素酶报告者和新霉素抗性报告者。来自卡蒂等人，2020年.

作为概念的证明，陶氏实验室用GFP荧光测试了他们的假设。为此，他们生成了一个沉默的GFP结构，该结构包含一个ACG起始密码子突变，并将其整合到表达Cas9或优化胞苷碱基编辑器的人类和小鼠细胞中。然后，实验室将靶向GFPACG的sgRNA引入细胞。正如预期的那样，只有含有胞苷碱基编辑器的细胞表现出强烈的GFP荧光诱导，证实了氧化石墨烯作为碱基编辑报告器的功效。

由于蛋白质翻译的起始密码子ATG是通用的，陶氏实验室成功使用GO诱导了一系列不同的报告基因的翻译，包括mScarlet-I、荧光素酶、抗生素抗性标记物和其他酶，如crea重组酶，大大扩展了碱基编辑报告基因工具箱。陶氏实验室还证明，GO是一种有效的报告腺嘌呤基编辑,使A-to-G对基因组进行编辑(Gaudelli等人，2017)。因此，GO是一种灵活的、适应性强的工具，用于识别和丰富体内碱基编辑事件。

TLDR：来自陶氏实验室的Gene On（GO）是一个灵活的报告系统，用于体内基本事件编辑。由于GO依赖于突变起始密码子的修正来启动蛋白质表达，因此它可用于一系列可检测的蛋白质，包括荧光蛋白、抗生素抗性和荧光素酶。金宝搏app下载

参考文献

Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR(2017)不进行DNA切割的基因组DNA中A•T到G•C的可编程碱基编辑。自然551:464 - 471。https://doi.org/10.1038/nature24644

Glaser A，McColl B，Vadolas J（2016）GFP到BFP的转化：一种用于定量CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的通用分析方法。分子治疗-核酸5:e334。https://doi.org/10.1038/mtna.2016.48

Katti A、Foronda M、Zimmerman J、Diaz B、Zafra议员、Goswami S、Dow LE（2020）GO：识别和丰富基本编辑活动的功能报告系统。核酸研究48:2841–2852。https://doi.org/10.1093/nar/gkaa124

Martin AS, Salamango DJ, Serebrenik AA, Shaban NM, Brown WL, Harris RS(2019)一组eGFP记者通过APOBEC-Cas9编辑体复合物进行单碱基编辑。科学报告9:。https://doi.org/10.1038/s41598-018-36739-9

St. Martin A, Salamango D, Serebrenik A, Shaban N, Brown WL, Donati F, Munagala U, Conticello SG, Harris RS(2018)用于定量和富集活细胞中apoec - Cas9或Cas9切割DNA编辑的荧光报告。核酸研究46:e84-e84。https://doi.org/10.1093/nar/gky332

standard - beier K, Tekel SJ, Brookhouser N, Schwarz G, Nguyen T, Wang X, Brafman DA(2019)人类细胞编辑富集(TREE)的瞬时报告。核酸研究47:e120-e120。https://doi.org/10.1093/nar/gkz713

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