这篇文章由客座博主贡献，路加福音Lavis霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院的小组组长。
化学已死，化学万岁！
的发现绿色荧光蛋白引发了生物成像的复兴。突然间，细胞生物学家不再受制于化学家和(昂贵的)合成荧光团。加入少量的DNA和电震，细胞就完全能够自行合成荧光团融合。后续的发展金宝搏app下载复制了许多小分子独有的特性:红移光谱,离子敏感,光活化这些令人印象深刻的进展引出了一个明显的问题：在这个绿色荧光蛋白及其类似物的时代，细胞生物学家为什么要和化学家交谈？
一个原因是所谓的“光子预算”：每个样品都有有限数量的荧光团，每个荧光团在漂白前可以发射有限数量的光子。从生物样品中提取的信息量完全取决于光子预算，推进荧光显微镜的前沿通常需要更多的光子。例如，从transie蛋白质融合到基因编辑细胞的nt过度表达可减少荧光团的数量，从而影响光子预算。同样，从整体成像到单分子成像的转变对光子预算造成了更大的负担，光子预算决定了我们可以跟踪单个分子的时间和精度。光子预算差是一个严重的问题espread关于荧光蛋白的问题即使是最节俭的细胞生物学家也会感觉像一个大学生在沙发垫上寻找零钱，不顾一切地想从样本中提取更多的光子。金宝搏app下载
化学荧光团在本质上比荧光蛋白更亮、更稳定，这为改进光子预算提供了一种直接的方法。金宝搏app下载当然，“还原”小分子染料似乎令人望而却步——没有人愿意把他们的日子花在向细胞中微注射荧光偶联物上。幸运的是，在过去的20年里，聪明的化学家和生化学家已经开发出技术，使标记化学更容易，在复杂的生物环境中，如活细胞和组织更有功能(图1)。这些灵活的策略给你两个世界的好处:化学染料优异的光物理性能与荧光蛋白的易变性和特异性相结合。金宝搏app下载
标签- sensing策略
大多数细胞内标记策略有两部分:(1)一个基因编码的“标签”，表达为与你喜欢的蛋白质的融合;(2)一个合成的含荧光基团的“配体”，与标签结合。像大多数生物成像的好想法一样，细胞内标记技术的最初突破是由钱永健他表示，双砷染料配体（如FlAsH、ReAsH）与短基因编码的四半胱氨酸（Cys）之间的选择性相互作用4.肽标签可以用来标记细胞中的蛋白质(图1a）.根据这一概念制定的其他战略包括:
- 工程连接(例如硫辛酸连接酶、生物素连接酶、磷酸腺苷转移酶) -这些酶催化荧光团配体与肽标签的共价连接(图1c)。
- 点击“化学”(例如，环辛烯四嗪)-非天然氨基酸可以被纳入蛋白质结构，然后与生物正交化学反应的生长工具箱一起使用(即，单击化学)，在特定的纳入位点上附着一个荧光团(图1d)。
- 氟激活蛋白-这些修饰过的抗体片段结合并增强小分子荧光素(图1e)。
- 污渍–这些标签由与内源性分子靶点（如紫杉醇）具有高亲和力的分子物种结合的荧光团组成。与其他系统不同，小分子结合基序靶点内源性蛋白质不需要基因编码标签（图1f）。
标签策略的利弊
所有这些标记策略都在基因编码标签的大小、荧光团附着的速度和选择性、共轭产物的亮度和系统的复杂性之间进行权衡。小分子标记策略的一个特别理想的特性是成氟性，这意味着配体在溶液中游离时荧光低，但与同源蛋白结合时荧光高。在某些情况下，这种特性使样品不需要去除多余的染料，这对于很难清洗的样品尤其重要，比如完整的组织。一些化学标记策略，如双砷染料(图1a)和FAP系统(图1e)本质上具有荧光性，其他几种可以使用环境敏感的荧光体进行荧光标记。总体而言，自标记标记系统(图1b)可能是活细胞标记的最佳方法，也是从荧光蛋白的最容易转换的方法，因为该系统相对简单，且荧光和荧光配体的可用性。金宝搏app下载
新的荧光团
作为这些创新标记策略的必然结果，一些研究小组——包括我的小组——一直在重新研究染料的旧化学。1856年，世界上第一个合成染料莫万被发现威廉·帕金他的发现引发了一系列的活动，大多数经典的小分子荧光团，如罗丹明（图2a），都是在19世纪发现的th许多小分子标记技术都集中在这种经典的净中性染料支架上，因为它具有既定的化学性质、小尺寸、亮度和细胞通透性。在过去几十年中，对这种既定染料结构的进一步改进产生了先进罗丹明荧光团的商业面板，如Alexa F荧光和阿托染料，具有更好的亮度、光稳定性和光谱范围。然而，这些荧光团被设计为用于固定细胞成像的抗体和寡核苷酸标签，而不是用于活细胞应用。因此，这些荧光团通常体积庞大，且含有极性基团（图2b）我们最近发现，加入四元氮杂环可以显著提高经典罗丹明及其类似物的亮度和光稳定性，而不会牺牲它们的小尺寸和膜通透性（图2c）。这些细胞是可渗透的Janelia氟(JF)染料在活细胞内具有优异的性能，特别是用于高级成像实验。我们继续开发具有不同光谱特性、高荧光性、光激活性和功能性的衍生物在活的有机体内．＊
最终的想法
使用的便利性和荧光蛋白的持续改进使它们成为许多(如果不是大多数)荧光显微镜实验的首选。金宝搏app下载然而，当你的预算有点少的时候，小分子标记方法可以为你的成像实验提供新的光子注入。创新的标记策略和改进的荧光团使化学染料对细胞生物学家越来越有吸引力和可接近——我们还没有完成。对这些系统的进一步改进——更小的标签、更亮的偶联物、更高的荧光性、光活化等——可以进一步增加光子的预算，使我们能够进一步推进生物成像的前沿。
*担心你的预算?电子邮件janeliafluor@janelia.hhmi.org来试用JF染料。
致谢
我感谢《财富》杂志的一位文字专家布雷特·门斯的有益评论。
非常感谢我们的客座博主Luke D. Lavis!这篇博文中的所有图片都是由Luke D. Lavis贡献的。
Luke D.Lavis目前是Howard Hughes医学院Janelia研究院的组长。他更愿意在实验室为高级成像设备制造新的荧光团。在twitter上关注他@罗丹明110.
参考文献
1.刘、哲、卢克·d·拉维斯和埃里克·贝齐格。“在单分子水平上成像活细胞动力学和结构。”分子细胞58.4(2015): 644 - 659。PubMedPMID: 26000849.
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3.卢克·D·拉维斯和罗纳德·T·雷恩斯：“化学生物学的好主意。”ACS化学生物学3.3(2008): 142 - 155。PubMedPMID: 18355003公共医疗中心PMCID: PMC2802578.
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