超越血脑屏障：PHP.B通过LY6A受体进入中枢神经系统

血脑屏障(BBB)是基因治疗中枢神经系统疾病的最大障碍之一。血脑屏障的作用是阻止病原体进入中枢神经系统，但这也阻止病毒载体，如腺相关病毒(AAV)到达它们的目标。188完整比分直播

AAV9血清型在注射入血液后会破坏血脑屏障，但需要高剂量的载体，因此无法做到到达中枢神经系统的所有区域. PHP.B是AAV9的一种神经营养变体，在静脉注射后进入C57BL/6J小鼠的中枢神经系统方面优于AAV9，但无法到达BALB/cJ小鼠的中枢神经系统。这些结果令人惊讶，因为体内AAV血清型的转导通常在小鼠品系之间进行跟踪．这表明，这两只老鼠之间微小的遗传差异可能导致它们的表型差异。两个实验室,德弗曼实验室在博德学院和威尔逊实验室在宾夕法尼亚大学，独立搜索了这一独特的DNA序列，并鉴定出淋巴细胞抗原6复合物（LY6A）作为PHP.B的受体。

继续阅读，学习如何设计PHP。Bmay have contributed to this mouse-specific performance, why LY6A is an unlikely receptor for PHP.B, and how the Deverman and Wilson labs determined LY6A was a receptor used by PHP.B viruses.

创建PHP。B,a neurotropic AAV9 variant

PHP.B对C57BL/6J小鼠的特异性可能是由于Deverman和格拉迪纳鲁实验室工程PHP.B。B是通过首先生成AAV9突变体的多样性文库创建的，该文库在AAV9衣壳中插入了一个小的随机肽环。然后对该突变文库进行了筛选体内在C57BL/6J小鼠品系中鉴定静脉注射后到达中枢神经系统的变异。与AAV9相比，PHP。B有一个>增加40倍的CNS转导，并转导大多数星形胶质细胞和神经元跨越多个CNS区域．PHP。eB, PHP的增强版。B,shows similar transduction efficiency, but at alog比PHP低剂量。B．

A.Ly6a变量链接到PHP。B CNS放纵

Deverman和Wilson实验室都确定LY6A，也被称为干细胞抗原-1 (SCA-1)，是PHP使用的受体。B到达CNS;然而LY6A不太可能成为候选人。它被发现时是抗原在活化的淋巴细胞上上调，常用来富集成年小鼠造血干细胞．其配体尚未确定。而LY6A或其他Ly6基因家族成员与病毒易感性有关(小鼠腺病毒;HIV1,西尼罗河,流感在人类中)，LY6A在病毒易感性方面缺乏明确的作用。

Deverman和Wilson实验室分别鉴定出LY6A是PHP的受体。Bby looking for a unique sequence of DNA that was present in mice whose CNS was transduced by PHP.B but absent in mice who were not transduced by PHP.B.

Deverman实验室采取了一种广泛的方法，寻找属于该研究一部分的36种小鼠品系之间的遗传差异老鼠基因组计划. 他们将研究重点放在最有可能产生较大表型效应的SNP和小插入和缺失（INDEL），如影响基因表达、mRNA剪接或蛋白质编码区的SNP和小插入和缺失。他们总共测试了13个菌株，其中7个菌株被确定为允许使用PHP.B CNS转导，6个菌株被确定为不允许使用PHP.B CNS转导。两个基因与PHP.B许可表型相关，但只有一个，Ly6a，显示了C57BL/6J小鼠和BALB/cJ小鼠大脑中蛋白质和RNA的差异表达，表明它可能参与了PHP.B许可。

威尔逊实验室也在寻找导致PHP的基因变体。小鼠B型纵容表型。他们采用经典的遗传学方法，将C57BL/6J和BALB/cJ小鼠杂交，绘制PHP的遗传模式。B放纵。第一代外系小鼠(F1) CNS PHP水平仅为正常小鼠的一半。作为C57BL/6J亲本。第二代非亲缘小鼠(F2)也显示出孟德尔遗传模式，表明有一个单一基因有两个共显性版本或等位基因驱动PHP。B表型。相关杂交小鼠的外显子组测序将搜索范围缩小到小鼠染色体的~4.5 Mbp区域。位于这段DNA中的基因Ly6a似乎是最有可能的候选者，因为它与PHP有很强的链接。B表型及其在小鼠大脑中的表达模式。

随后，两个实验室都采用了类似的方法来验证LY6A作为PHP.B受体的作用。Deverman实验室从观察LY6A表达式的变化如何影响PHP开始。B的传导率。敲除的Ly6a在原代C57BL/6J中，脑内皮细胞的转导率降低，而C57BL/6J版本的Ly6a在293T细胞中增强PHP。B转导率。该小组还确定了小鼠品系特异性的效果Ly6a单核苷酸多态性在PHP。B绑定体外．他们发现当LY6A含有C57BL/6J单核苷酸多态性时，PHP。Bcould bind it, but when LY6A contained BALB/cJ SNPs, binding was reduced.

然后，Deverman小组观察PHP.B是否需要其亲代AAV9所依赖的转导细胞的相同受体：半乳糖和AAV受体（AAVR）．缺乏半乳糖的细胞系仍然通过PHP转导。但仅当Ly6a是表达。此外，当AAVR敲除小鼠IV注射PHP时。eB, PHP的增强版。B,virus still reached the brain endothelial cells of these mice, although at lower levels than in AAVR wild-type mouse. These results suggested that PHP.B, unlike its parental AAV9, does not require galactose and AAVR to transduce cells.

Wilson实验室在研究LY6A蛋白和RNA表达模式、C57BL/6J和BALB/cJ旁小鼠品系的PHP.B许可表型以及过表达Ly6a关于PHP.B对293T细胞的转导。此外，威尔逊实验室还测试了PHP.B转换a的中枢神经系统的能力Ly6a静脉注射后敲除C57BL/6J小鼠。毫不奇怪，没有检测到大脑传导。他们还使用ELISA来测量PHP.B与可溶性LY6A的结合。他们发现PHP.B和LY6A的C57BL/6J版本之间存在绑定，但是PHP.B独特的衣壳环的突变破坏了绑定。总的来说，这些结果表明PHP.B使用LY6A受体进入中枢神经系统。

病毒载体许可的底线

虽然PHP。Bhas impressive CNS transduction in some strains of mice, these results are not reproduced when the vector is used in different mouse strains. The体内选择为PHP。Bin C57BL/6J mouse strains likely contributed to the unintentionally selection of a virus with mouse-strain dependent performance. This surreptitious finding illustrates how the method used to select novel AAV capsid variants could unintentionally limit the utility of candidate capsids.

您对使用AAV-PHP.B向量感兴趣吗？见附录中的补充表3黄等。获取PHP列表。Bpermissive and non-permissive mouse strains.PHP.B质粒和PHP.eB病毒制剂可从Addgene获得。

参考文献

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如果你对PHP感兴趣。Bperformed in non-human primates, check out these two references:

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如果您想进一步了解PHP.B和PHP.eB是如何设计的，请查看以下两个参考资料：

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