本文由罗彻斯特大学医学中心的帕特里克·米勒-罗兹撰写。
你可能听说过共振能量转移(FRET)．通过相邻荧光团之间的非辐射能量转移，FRET可用于检测蛋白质功能下的分子间和分子内相互作用。然而，FRET实验在实践中很难实施，因为FRET依赖于许多难以实现的因素。例如，FRET要求融合蛋白靠近并以足够大的数量(和正确的化学计量比)出现，以生成可用的数据。更重要的是,测量和量化FRET说起来容易做起来难。
幸运的是，存在一种互补的方法来可视化蛋白质相互作用(PPIs):双分子荧光互补(BiFC)。
什么是双分子荧光互补?
双分子荧光互补是一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，它使用分离的荧光蛋白连接到潜在的蛋白质相互作用伙伴。金宝搏app下载与FRET不同的是，BiFC只使用单一的荧光蛋白来可视化PPIs。这个荧光蛋白(FP)分裂成两个单独缺乏荧光的片段。当互补的FP片段与两个假设的蛋白质相互作用伙伴(pip)融合时，FP片段形成完整的FP，因为它们被栓系在pip上，使它们靠近(图1)。完整FP的形成产生荧光信号，可以通过荧光显微镜检测。
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| 图1:BiFC如何工作。分裂的FP(例如，黄色荧光蛋白，YFP)通过两个pip之间的相互作用而重聚，从而产生荧光读数。 |
双分子荧光互补的应用
BiFC已经习惯了直接可视化调控大量细胞功能的PPIs，包括泛素化、激酶信号、整合素信号和转录因子相互作用(Kerppola, 2006)。最早的BiFC研究之一使用了这种方法询问碱性亮氨酸拉链和Rel转录因子之间相互作用的亚细胞定位(Hu et al.， 2002)。这对于FRET来说就更加困难了，因为它所需要的融合蛋白的过表达可能会导致所研究的pip的异常亚细胞定位。
BiFC的直接性质也使它更容易生成大量结构体用于高通量筛选PPIs。例如，Bischof等(2018)生成了一个开放阅读框(open reading frame, ORF)文库，用于在活果蝇的450个转录因子中筛选PPIs。尽管BiFC开放阅读框架(ORF)库已经生成酵母(Kim et al.， 2019)和果蝇(Bischof et al.， 2018)，在基因易驾驭性较差的生物体中，此类资源的产生滞后。
BiFC还可用于筛选特定PPI的小分子抑制剂。在这样的实验中，小分子抑制剂被平行地测试他们的能力，以防止由检测的PPI产生的BiFC。这个高通量应用程序执行起来要简单得多，因为它依赖于单个BiFC对。
如何设计BiFC实验
就像FRET一样，BiFC实验必须经过仔细的优化才能成功。BiFC实验一般包括三个步骤:融合蛋白构建、细胞表达和定量(Kerppola 2006，2013）.下文将对此作更详细的说明:
融合蛋白结构
将FP片段与pip融合需要仔细选择FP片段，最好还需要一些关于测试pip结构的信息。许多分裂FPs都是如此验证为BiFC(Kodama和Hu, 2012)。大致了解pip可能如何交互将允许您确定在何处融合FP片段。在缺乏此信息的情况下，可以将每个FP片段融合到每个PIP的N端和c端，并根据经验测试哪种组合提供最好的荧光信号。对于链接序列，氨基酸序列RSIAT和RPACKIPNDLKQKVMNH已经成功使用(Kerppola, 2006)。灵活的GS连接器也可以工作。您还需要生成负控制结构—稍后将详细介绍。更多关于构建融合蛋白的内容，请查看我们的文章:金宝搏app下载荧光蛋白101:GFP融合蛋白-建立正确的连接．
细胞表达
BiFC构建物是瞬时表达还是稳定表达影响到BiFC实验的成功。无论在哪种情况下，都应避免过表达，因为由于FP片段之间独立于PPIs的随机关联，会产生高背景荧光水平。通过使用western blotting比较BiFC构建物和内源性对等物的表达水平，可以评估过表达。BiFC结构的亚细胞定位还应与内源性结构的亚细胞定位进行比较(例如通过免疫细胞化学)，因为这也可能受到超病理表达水平的干扰。
BiFC量化
这就是BiFC优于FRET的地方——BiFC实验只需要你对单个FP的荧光进行成像和测量。由于FPs与ppi之间的随机关联，您的控制结构可能会产生适度水平的荧光。简单地比较BiFC结构和阴性对照的荧光强度，以确定pip实际上是否相互作用。
选择正确的阴性对照是BiFC实验成功的关键。理想的控制是一个或两个pip的突变变体其中蛋白相互作用界面已被破坏(Kodama和Hu, 2012)。这样的控制是必要的，因为分割FPs可以关联，尽管频率相对较低，而不需要被pip拉近距离。FP片段本身不能用作阴性对照，因为它们的表达水平、稳定性和亚细胞定位可能与你的BiFC结构不同，这使得解释你的结果很困难。不幸的是，在没有结构信息的情况下，构建适当的控制可能需要您经验地测试一些突变体，以识别那些在您的细胞系统中抑制BiFC的突变体。
BiFC竞争分析可以用来代替阴性对照(Kerppola, 2006)。在这里，一个内源性pip在您的BiFC结构中以递增的水平表达。如果你的pip确实相互作用，共同表达一个内源性pip应该以剂量依赖的方式降低BiFC信号。这在易于转染的细胞系中是简单的，质粒的剂量可以严格控制。这在理论上也是可能的，但在慢病毒表达方面可能更具挑战性。
有关如何设计BiFC实验的更多细节，详细的故障排除技巧可以在Kerppola (2006，2013）.
BiFC vs. FRET:何时选择其中之一
BiFC是一种方便的、基于荧光的方法，可以直接显示细胞中的PPIs。与FRET相比，BiFC易于可视化，使其易于在相对生理条件下研究PPIs。然而，值得注意的是，BiFC是不可逆的——FP片段通过相互缔合形成共价键——这意味着它不能用于测量pip的离解。因此，BiFC在需要简单的是-否答案的情况下是有用的，例如，两个蛋白质是否相互作用?-当PPIs的时间动态是研究重点时，FRET更可取。
非常感谢来自罗切斯特大学医学中心的客座博主Patrick Miller-Rhodes !
帕特里克是神经学家、作家和极限运动爱好者。他最近获得了罗切斯特大学医学中心的神经科学博士学位，在那里他使用分子生物学技术研究炎症和神经变性。现在，只要不在圈子里，他就会把时间花在学习和写作科学方面。
参考文献
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Hu C-D, Chinenov Y, Kerppola TK(2002)利用双分子荧光互补技术在活细胞中可视化bZIP和Rel家族蛋白的相互作用。分子细胞9:789 - 798。https://doi.org/10.1016/s1097 - 2765 (02) 00496 - 3
Kerppola TK(2006)设计和实现双分子荧光互补(BiFC)分析，以可视化活细胞中的蛋白质相互作用。Nat Protoc 1:1278 - 1286。https://doi.org/10.1038/nprot.2006.201
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Kim Y, Jung JP, Pack C-G, Huh W-K(2018)酵母蛋白同源化的全球分析。基因组Res 29:135 - 145。https://doi.org/10.1101/gr.231860.117
双分子荧光互补技术(BiFC)的研究进展与展望。生物技术53。https://doi.org/10.2144/000113943
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