利用CRISPR多路捕获启动子-增强子三维染色质结构

最初发布于2017年12月7日，更新于2020年7月2日。

启动子可能是基因调控的明星，但增强子和染色质环起着重要的支持作用。增强子是顺式调节的DNA序列，当与转录因子结合时，可以增加基因的转录。有时增强子位于远离它们所调节的基因数千个碱基对的地方，但通过染色质环(形成染色体的DNA和蛋白质复合物)将它们带到附近。

这些长程DNA相互作用通常是通过基于染色体构象捕获(3C)的方法，如5C或Hi-C (Han et al.， 2018)。3C方法可以认为是通过分析DNA测序数据，用“开发”的照片拍摄染色质环。虽然用目前的3C方法生成的“图片”提供了有关染色质相互作用的有用信息，但它们是颗粒状的，所以很难弄清楚细节。为了提高分辨率徐实验室创建一个基于dcas9的捕获(CRISPR亲和纯化)原位（监管要素）方法。最初的CAPTURE方法于2017年发布并解决了3C方法的许多缺点，但一次只能检测基因组中一个位置的染色质相互作用(Liu et al.， 2017)。最近徐实验室开发了捕捉2.0，一种更新版本的CAPTURE，可一次检测数百个位点上的染色质相互作用(Liu等人，2020)。

调控元件CRISPR亲和原位纯化:原始的CAPTURE方法

最初的捕获方法需要建立一个稳定的细胞系，共表达三种成分：

1. 添加生物素受体位点的dCas9
2. BirA，生物素连接酶
3. 以单个基因组位置为目标的gRNA

当这三个组分共同表达时，gRNA将dCas9靶向于感兴趣的位点，dCas9通过BirA进行生物素化。从这里，捕获方法类似于其他3C方法：交联捕获染色质相互作用，限制性内切酶消化将DNA切割成更小的片段，近距离连接产生DNA嵌合体圈，这些嵌合体圈在空间上呈线性距离但紧密相连。然后通过PCR或下一代测序检测这些嵌合DNA片段，形成染色质“图片”。

图1:CAPTURE方法的关键步骤概述。蛋白质和DNA复合物交联后，DNA被消化成更小的片段。然后将产生的粘性末端连接在一起，形成DNA环。这是连接DNA片段的关键，这些DNA片段在碱基对上距离很远，但在物理位置上距离很近。然后DNA被剪切成足够小的片段，可以通过链霉亲和素IP拉下来。生物素化的dCas9在所有这些步骤中都在继续，直到它与DNA的连接在交联逆转中断开(没有在图中显示)。交联是反向的，这样DNA片段就可以通过PCR或深度测序来检测。

原始捕获方法的一个缺点是必须为每个感兴趣的基因组位点创建一个新的细胞系。这很麻烦，也很难在多个靶点之间比较结果，因为不同的捕获细胞系将具有不同水平的dCas9和gRNA表达。此外，基于CAPTURE 3C的测序需要大量细胞（~5x10^7.）.这两种要求一起阻止了对原始细胞或稀有细胞群使用CAPTURE。

CAPTURE 2.0系统的关键组件

为了改进原始捕获方法，Xu实验室对创建CAPTURE 2.0进行了以下更改：

1. 用BioTAP标签替换dCas9上的BioInatable标签。这个生物标签是一个69 aa长的生物素化靶向序列，由真核细胞中正常表达的生物素连接酶识别。使用此标签可将需要传递到细胞的捕获成分数量从三个减少到两个。
2. BioTAP标记的dCas9和gRNAs的慢病毒递送。使用慢病毒递送剩余的两种CAPTURE 2.0组分消除了创建稳定细胞系的需要，并允许CAPTURE 2.0与原代细胞一起使用。

为CAPTURE 2.0找到质粒!

与原始捕获相比，CAPTURE 2.0在具有良好特征的β-珠蛋白基因座启动子处的染色质相互作用捕获率增加了约14倍。这两种方法对实验中靶向的DNA序列具有相似的特异性。

图2:CAPTURE和CAPTURE 2.0的比较。

表1:原始CAPTURE和CAPTURE 2.0方法之间的主要区别。

CAPTURE 2.0的应用

CAPTURE 2.0提高了检测染色质相互作用的速率，为回答更多关于染色质构象的问题打开了大门。Xu实验室提出了三种使用CAPTURE 2.0的方法:

1.染色质相互作用的多重捕获

徐实验室进行了一个概念验证实验，以证明CAPTURE 2.0可以同时检测多个染色质相互作用。利用CAPTURE 2.0技术分析了β -珠蛋白位点五个位点的染色质相互作用，每个位点都有两个grna靶向。他们发现，在实验中，gRNA靶向的DNA序列富集程度最高，而阴性对照gRNA或预测gRNA脱靶位点靶向的DNA几乎没有富集。与多路CAPTURE 2.0鉴定的长程染色质相互作用在很大程度上复制了之前与原始CAPTURE方法鉴定的相互作用。两种捕获方法都优于其他3D染色质方法，如家养宠物或不同的无酒精饮料品牌通过增加所识别的独特染色质相互作用的数量和靶上富集的水平。

2.确定染色质相互作用网络的空间和层次结构

CAPTURE 2.0的第二个应用是构建空间和层次染色质相互作用网络。把这些染色质相互作用的网络想象成一个社交网络。它们可以告诉你诸如哪些增强子与哪些启动子相互作用，增强子喜欢与基因的哪个部分相互作用，以及每个增强子与多少个启动子或基因相互作用。超级增强子是构建染色质相互作用网络的很好的模型，因为它们是一个大型的增强子集群。CAPTURE 2.0的多路复用和高分辨率允许徐实验室同时描述157个超级增强子的“社交网络”。

3.测量染色质相互作用的时间变化

CAPTURE 2.0的第三个应用是检测染色质构象的时间变化，比如在发育和细胞分化过程中发生的变化。通过细胞系模型，Xu实验室跟踪了红细胞分化过程中增强子-启动子的相互作用。

CAPTURE 2.0捕捉染色质在基因调控中的动态作用

使用CAPTURE 2.0生成的高分辨率和多路染色质“照片”允许我们揭示染色质相互作用的新细节和模式。CAPTURE 2.0讲述的染色质故事很重要，但它不是基因调控中唯一的情节线。当染色质构象数据与基因表达、染色质可及性和表观遗传修饰的变化进行比较时，我们可以开始建立一个围绕基因表达变化的事件时间表，并确定谁是这些变化的关键驱动因素。通过生成更生动的染色质图像，CAPTURE 2.0改写了基因调控的脚本。

参考文献

韩杰、张志强、王坤（2018）。3C和基于3C的技术：空间基因组组织破译的强大工具。分子细胞遗传学，11。https://doi.org/10.1186/s13039-018-0368-2

Liu X, Zhang Y, Chen Y, Li M, Zhou F, Li K, Cao H, Ni M, Liu Y, Gu Z, Dickerson KE, Xie S, Hon GC, Xuan Z, Zhang MQ, Shao Z, Xu J (2017) In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9。细胞170:1028 - 1043。e19。https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.08.003

刘，X.，陈，Y.，张，Y.，刘，Y.，刘，N.，博滕，G.A.，曹，H.，奥金，S.H.，张，M.Q.，徐，J.（2020）。通过生物素化dCas9对位点特异性3D染色质的空间结构和时间动态的多重捕获。基因组生物学，21.https://doi.org/10.1186/s13059-020-01973-w

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