rna编辑Cas13酶已经席卷CRISPR领域。就像RNA干扰一样，这些酶可以在不改变基因组的情况下敲除RNA，但cas13具有更高的靶向特异性。新工作konermann等。和yan等人。描述了新的Cas13d酶，平均只有2.8 kb大小，很容易打包在低容量的载体!这些小而强大的iv - d酶是转录组工程工具箱中的最新工具。
CAS13D酶是如何发现的？
微生物CRISPR的多样性令人印象深刻，研究人员刚刚开始挖掘CRISPR的丰富可能性。为了识别Cas13d，两组研究人员都使用了非常普遍的生物信息学筛选，在假定的效应核酸酶附近寻找CRISPR重复序列。他们鉴定的Cas13d蛋白与之前鉴定的Cas13a-c同源蛋白序列几乎没有相似之处，但它们确实包含Cas13超家族特征的HEPN核酸酶域。Yan等人继续研究来自sirobacterium sirafauum（ESCAS13D）和喇叭喇叭sp。（rspcas13d），而konermann等。来自“Anaerobic Digester Metagenome”（ADMCAS13D）和瘤胃球菌属flavefaciens（昵称为CASRX），以及ESCAS13D。
Cas13d酶与其他Cas13s酶相比如何?
像其他Cas13酶一样，这些论文中描述的Cas13d同源物可以独立地处理自己的CRISPR数组，成为引导rna。crRNA切割在dCas13d中被保留，因此是不依赖于hepn的。这些酶也不需要原间隔体的侧翼序列，所以你几乎可以瞄准任何RNA序列！！在细菌中，CAS13D介导的裂解促进其他RNA的抵押品切割。与其他CAS13一样，当CAS13D在哺乳动物系统中表达时，不会发生这种抵押品裂解。
由于CAS13D在功能上类似于先前发现的CAS13酶 - 因此使这些矫形器如此特殊？第一个属性是尺寸 - CAS13D酶的中间长度为〜930AA - 使它们比其他CAS13小于其他CAS13的17-26％，比Cas9小33％！它们的小尺寸随后使易于包装在低容量向量，如AAV，由于其低免疫原性导致的流行载体。但这些研究还确定了其他优点，包括Cas13D特异性调节蛋白和高靶向效率，两者在下面描述。
Yan等:含有wyl结构域的辅助蛋白WYL1增加了RspCas13d和EsCas13d的切割活性
大多数VI-D型基因座含有带有WYL结构域的副蛋白(以该结构域内的三个保守氨基酸命名)。Yan等人来自阿伯生物技术发现RspCas13d辅助蛋白RspWYL1提高了RspCas13d对靶RNA和副RNA的降解。RspWYL1也增加了EsCas13d的活性，这表明含有WYL结构域的蛋白可能是Cas13d活性更广泛的调控因子。这种特性使WYL蛋白质成为有趣的对应物抗克隆蛋白负调控Cas酶的活性，其中一些也在多种物种中起作用(阅读Arbor Biotechnologies关于其Cas13d沉积的新闻稿)在这里）。
Konermann等人:CasRx是一种高效的哺乳动物细胞特异性编辑器
并非所有CAS13D蛋白质在哺乳动物细胞中都是功能性的，但Konermann等人。通过Casrx和Admcas13D融合到核定位信号（NLS），看到了很棒的结果。在HEK293 MCHERRY报告器测定中，CASRX和ADMCA13D分别通过流式细胞术测量92％和87％的MCHERRY蛋白敲低。CAS13D CRISPR阵列处理具有鲁棒，CASRX和一个未处理或加工的GRNA阵列（具有30nt直接重复的22个NT间隔），调解有效敲低。从CRISPR阵列复用产生> 90％的CASRX敲击四个目标，包括两个MRNA和两个核长非编码RNA。
CAS13D酶的一个有趣的扭曲是它们的裂解模式：即使在靶RNA上铺面均铺面，ESCA13D也产生了非常相似的裂解产品，表明该酶在距目标区域的可预测距离处不粘连。konermann等。表明Escas13D求解尿嘧啶的切割，但需要更详细地探索这种切割模式。
Konermann等人将CasRx与多种RNA调控方法进行了比较:小发夹RNA干扰、dcas9介导的转录抑制(CRISPRi)和Cas13a/Cas13b RNA敲低。CasRx是明显的赢家，其中位敲减率为96%，shRNA为65%，CRISPRi为53%，其他Cas13a和Cas13b效应子为66-80%。与之前描述的Cas13酶一样，CasRx也表现出非常高的靶向效率;shRNA处理产生500-900个显著脱靶，CasRx显示为零。与Cas9不同，CasRx的引导rna的效率差异很大，但每个引导rna都有>80%的敲低。看起来，CasRx可以使其靶向细胞中的任何RNA。
由于催化死亡的dCasRx保持其RNA结合特性，Konermann等人测试了它通过外显子跳跃操纵RNA物种的能力。之前的CRISPR外显子跳过方法使用两个引导rna从基因组中移除给定的外显子，并显示出成功肌营养不良的模型。在这种情况下，konermann等人。有针对性的MAPT，编码痴呆症相关tau蛋白的基因，传递dCasRx和靶向3-间隔体阵列MAPT外显子10接头受体和两个推定的接头增强剂。在AAV介导的递送至IPS衍生的皮质神经元后，DCASRX介导的外显子跳过致病成致致病性TAU的比例近50％，显示DCASRX预临床和临床应用的概念证明。
VI类CAS13D酶的鉴定是BioIncormatic数据挖掘的另一个Win。随着我们继续利用CRISPR系统的自然多样性，只有时间将判断基因组和转录组工程工具箱的大大大。然而，它确实存在CrispRp科学分享的影响将继续增长，我们在Addgene欣赏我们的存款人，以便将其工具提供给更广泛的社区。
参考文献
Konermann，Silvana等。“具有RNA靶向型VI-D型CRISPR效应的转录组工程。”细胞pii (2018): s0092 - 8674(18) 30207 - 1。PubMedPMID：29551272
- 这篇论文中的质粒是可用的在Addgene。
燕，温斯顿X.等人。“CAS13D是一种紧凑的RNA靶向型VI CRISPR效应器，其由含有含Wyl结构域的辅助蛋白呈正地调节。”摩尔细胞。pii (2018): s1097 - 2765(18) 30173 - 4。PubMedPMID: 29551514
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- 了解CRISPR RNA编辑与修复
- 获取使用提示Cas9转录激活物
- 了解Cas13a (C2c2)表征
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