Gabrielle Clouse于2020年10月7日更新。
本文由威斯生物工程研究所的客座博主Marcelle Tuttle和Alex Chavez贡献。
CRISPR/Cas9这是一个巨大的塑料工具，已经席卷了科学界。虽然Cas9已被最广泛地用于在DNA中创建特定编辑，但在构建Cas9转录激活剂方面也有重要的工作。通过将缺乏DNA切割活性的Cas9突变体融合到转录激活域，这些结构允许基本上任何基因的上调（图1）。
使用CRISPRa进行研究的两种方法
CRISPRa用于特定的基因靶标
具有已知功能的基因的CRISPR激活有可能用于治疗，因为它可以增加某些位点的基因表达，从而改变表型。例如，CRISPR激活已用于诱导多能干细胞的分化（Chavez et al.，2015）通过激活导致分化的基因和逆转HIV病毒潜伏期(Bialek et al.， 2016)。
此外，基于CRISPR的激活可以根据环境触发因素进行诱导。这是通过创建一个分裂的dCas9蛋白来完成的，当暴露在特定的紫外线波长或化学物质下时，该蛋白可以重新组装(Polstein和Gersbach, 2015;Zetsche et al.， 2015)这些类型的CRISPR激活也是可逆的：一旦环境触发因素离开，基因表达就不再被激活。
然而，有几个因素可能会阻止你的基因被上调。例如，一般来说，在自然条件下，基因表达越高，你使用CRISPRa获得的激活就越少。你感兴趣的基因可能已经达到了当前Cas9系统无法帮助你通过的激活上限。此外，激活实验通常需要相当多的调整才能知道系统是否按预期工作。最后，对于要激活的每个基因，您还应该准备好测试三到四个指向该基因的引导，因为引导效力可能会有很大差异。
因此，如果用户想激活单个基因，我们建议使用cDNA过表达载体，而不是进行基于cas9的激活所需的所有故障排除。
CRISPRa用于全基因组研究
最好的用途之一Cas9活化剂就是基因筛选。例如，以人类基因组中的每个基因为靶点的grna，可以使用寡聚文库合成法轻松而廉价地制造出来。在Cas9激活剂之前，类似的工具是使用其他DNA结合蛋白如锌指蛋白(ZF)和TAL效应蛋白(TALE)制成的。然而，与这些结构不同的是，Cas9允许你通过简单地提供一个新的gRNA，而不是工程一个全新的蛋白质，轻松地改变被激活物靶向的序列。这使得使用Cas9激活剂更加便宜。
这种更大规模的激活也为探索性研究提供了条件。例如，CRISPRa可以通过发现激活时导致癌细胞系细胞死亡的基因来发现潜在的抗癌药物靶点(Gilbert等人，2014年;Behan等人，2019年)由于CRISPRa能够同时针对多个基因位点，因此也可以用于绘制分子途径和遗传相互作用图。此外，基于CRISPR的大规模屏幕可用于深入了解蛋白质结构与功能(Pan等人，2018)。
cDNA文库，它由来自特定细胞类型或生物体的过表达编码序列的质粒组成，已经以类似于Cas9激活剂的方式被使用。然而，与grna相比，这些可能很难构建和交付。另外，cdna不能用于研究顺式由于许多时候，某一特定细胞类型的常见亚型是未知的或不容易获得的，因此无法轻易地传递特定基因的适当亚型。通过从基因的自然环境中激活，Cas9激活剂有效地解决了这些问题。
我应该使用哪种Cas9激活剂？
有多种激活剂你可以用它来做实验，我们发现山姆(Konermann等人，2014年)，Suntag（Tanenbaum等人，2014年，Gilber等人，2014年）),冲程体积（查韦斯等人，2015年）)是多种细胞系(HEK293T, MCF7, U2-OS, Hela, N2A, 3T3)和生物体的良好选择(Chavez et al.， 2016)。．要了解更多不同类型的Cas9激活剂，请查看我们的涵盖VP64、Suntag、SAM和VPR的博客文章。
少担心偏离目标
与Cas9的切割活性不同，脱靶效应通常被认为不是Cas9激活剂的大问题。被认为是如此的结果之前RNA-seq实验(Konermann et al ., 2014年查韦斯et al ., 2014年查韦斯et al ., 2016)以及一个相信的几率非常低,Cas9将有一个不相干的,落在另一个基因的启动子,从而推动异常转录。话虽如此，我们通常通过将基因的启动子放入gRNA发现者来选择引导基因，比如WU-CRISPR(Wong et al.， 2015))或我们的实验室sgRNA记分器1.0(Chari et al.， 2015)并选择最接近转录起始位点(TSS)的指南。我们建议在TSS上游低于200 bp的区域进行定向引导，以获得最佳效果，但最高可达400 bp，效果也比较好。
祝你的实验好运！
非常感谢我们的嘉宾博主Marcelle Tuttle和Alex Chavez!
马塞勒·塔特尔(Marcelle Tuttle)是塔夫茨大学(Tufts University)的一名医科学生，曾在威斯生物工程研究所(Wyss Institute for biological Inspired Engineering)担任研究员。
Alejandro (Alex) Chavez是Addgene科学顾问委员会的成员。他在哥伦比亚大学的实验室致力于通过创新技术推动科学发现。到目前为止，他的团队已经开发了几种流行的基于crispr的工具，用于改变DNA序列或调节基因表达。
参考文献
Behan FM、Iorio F、Picco G、Gonçalves E、Beaver CM、Migliardi G、Santos R、Rao Y、Sassi F、Pinnelli M、Ansari R、Harper S、Jackson DA、McRae R、Pooley R、Wilkinson P、van der Meer D、Dow D、Buser Doepner C、Bertotti A、Trusolino L、Stronach EA、Saez Rodriguez J、Yusa K、Garnett MJ（2019）使用CRISPR–Cas9筛选确定癌症治疗靶点的优先级。《自然》568:511-516。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1103-9
Bialek JK，Dunay GA，Voges M，Schäfer C，Spohn M，Stucka R，Hauber J，Lange UC（2016）使用CRISPR/Cas9衍生转录激活系统靶向HIV-1潜伏期逆转。PLoS ONE 11:e0158294。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158294
Chari R，Mali P，Moosburner M，Church GM（2015年）通过库对库方法揭示CRISPR-Cas9基因组工程参数。Nat方法12:823–826。https://doi.org/10.1038/nmeth.3473
Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, Tuttle M, P R Iyer E, Lin S, Kiani S, Guzman CD, Wiegand DJ, Ter-Ovanesyan D, Braff JL, Davidsohn N, Housden BE, Perrimon N, Weiss R, Aach J, Collins JJ, Church GM(2015)高效cas9转录程序。Nat方法12:326-328。https://doi.org/10.1038/nmeth.3312
查韦斯A、塔特尔M、普鲁特BW、埃文·坎本B、查里R、特·奥瓦内斯扬D、哈克SJ、塞奇RJ、科瓦尔·埃克、布赫塔尔J、霍斯登BE、佩里蒙N、柯林斯JJ、丘奇G（2016）多种物种中Cas9激活剂的比较。Nat方法13:563–567。https://doi.org/10.1038/nmeth.3871
Gilbert LA，Horlbeck MA，Adamson B，Villalta JE，Chen Y，Whitehead EH，Guimales C，Panning B，Ploegh HL，Bassik MC，Qi LS，Kampmann M，Weissman JS（2014）基因组规模CRISPR介导的基因抑制和激活控制。细胞159:647–661。https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.029
Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, jyoung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F(2014)基因工程CRISPR-Cas9复合物的基因组规模转录激活。自然517:583 - 588。https://doi.org/10.1038/nature14136
Pan J, Meyers RM, Michel BC, Mashtalir N, Sizemore AE, Wells JN, Cassel SH, Vazquez F, Weir BA, Hahn WC, Marsh JA, Tsherniak A, Kadoch C(2018)利用基因组规模Fitness筛选研究哺乳动物蛋白复合体结构、功能和成员关系。电池系统6:555 - 568。e7。https://doi.org/10.1016/j.cels.2018.04.011
Polstein LR，Gersbach CA（2015）《控制内源性基因激活的光诱导CRISPR-Cas9系统》，Nat Chem Biol 11:198–200。https://doi.org/10.1038/nchembio.1753
Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD(2014)一种用于基因表达和荧光成像信号放大的蛋白标记系统。细胞159:635 - 646。https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.039
王宁，刘伟，王旭(2015)WU-CRISPR: CRISPR/Cas9系统功能导向rna的特性。基因组生物学16:。https://doi.org/10.1186/s13059-015-0784-0
Zetsche B，Volz SE，Zhang F（2015）一种用于诱导基因组编辑和转录调控的分裂Cas9结构。Nat生物技术33:139–142。https://doi.org/10.1038/nbt.3149
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