这篇文章是由阿姆斯特丹大学分子细胞学和先进显微镜Van Leeuwenhoek中心的客座博主Joachim Goedhart和Marieke Mastop贡献的。
本系列的前两篇文章描述了一个实用的方法来选择一个明亮的荧光蛋白和一个photostable荧光蛋白．在本系列的第三篇文章中，我们将讨论如何选择非聚集荧光蛋白。
在水母Aequorea victoria， AvGFP形成同源二聚体。在珊瑚中，红色荧光蛋白形成四聚体。金宝搏app下载一般来说,金宝搏app下载具有天然亲和力和形成高阶聚集物的趋势。这种特性在某些应用中是可以容忍的(例如标记细胞或跟踪启动子活性)，但在荧光蛋白作为惰性蛋白模块的应用中是有问题的。这里有更详细的解释．有很多方法可以用来测量荧光蛋白的聚合倾向。这里讨论这些实验的基础和缺陷。
在体外测试聚合
纯化的荧光蛋白形成同型二聚体或高阶低聚体的趋势可以金宝搏app下载用几种技术进行分析。凝胶过滤和SDS-PAGE在非变性条件下根据大小分离蛋白质。是否检测到高分子量的配合物取决于同型二聚体亲和力和蛋白质溶液的浓度。在实验过程中，溶液被稀释，使解释变得复杂。正因为如此，这些方法只能给出二聚趋势的定性观点。另一种根据大小分离分子的技术是超离心法。沉淀平衡分析超离心法产生亲和力，并已用于证明黄色荧光蛋白均二聚化的特征是110µM (Zacharias等，2002年)，这意味着在这个浓度下50%的蛋白质会形成二聚体。最后，光谱方法(基于荧光偏振)可用于检测均二聚反应。然而，上述所有方法仅测定水溶液中均二聚反应的能力。
在阶段测试聚合
用纯化蛋白进行的同型二聚反应在多大程度上反映了荧光蛋白在细胞中相互作用或寡聚的可能性?金宝搏app下载这个问题基本上没有答案。理想情况下，荧光蛋金宝搏app下载白应该作为惰性模块，在细胞中不能同型二聚。为了了解荧光蛋白是如何达到这种理想状态的，人们金宝搏app下载提出了细胞检测方法。早期的研究测试了fp -微管蛋白融合蛋白是否能在细胞中正常形成微管网络。其他的工作测试了FP与连接蛋白的融合是否正确地定位于缝隙连接(Shaner等人，2008年）.专性二聚体(如dTomato)促进FPs之间的相互作用，干扰了天然相互作用，阻止了这些检测中的正确定位。然而，这些策略将不会检测到弱二聚趋势，如在EGFP中存在。
Constantini等人，(2012)开发了一种基于细胞的检测方法，可以更好地检测同型二聚趋势。该分析使用来自细胞色素p450的多肽，CytERM，以引导荧光蛋白到内质网(ER)。如果发生同质二聚(最可能是反平行结构)，典型的结构被称为有组织的光滑内质网(OSER)轮状是可见的。这些轮状细胞可以被单个细胞量化，“正常”细胞的数量也可以计算出来。本实验将提供活细胞二聚倾向的信息。令人惊讶的是，OSER实验显示tagRFP在细胞中并不是一个真正的单体(Constantini 2012)，而以往认为是基于凝胶过滤的单体(Chudakov等，2007年）.
我们已经开发了多种质粒，可以用于OSER分析，包括CytERM-mKOkappa，CytERM-mTurquoise2,CytERM-dTomato．
当使用和解释OSER试验结果时，您应该记住，螺纹的存在可能是浓度依赖和细胞类型依赖的。因此，在开始你的实验之前，用你感兴趣的细胞类型中选择的FP来执行这个实验是一个很好的实践。
选择一种非低聚蛋白
如果一个荧光蛋白的名称前有一个“m”表示它是单体，就不能认为它是非二聚体化的。没有相关数据证明荧光蛋白是单体的说法是毫无价值的。OSER分析是目前检测荧光蛋白同源二聚倾向的最好方法。一些研究已经使用OSER分析来证明细胞中的单体行为(Shaner et al, 2013；Bindels等人，2017年）.
尽管如此，在使用论文中提供的数据时应该谨慎，因为研究之间的差异是巨大的(例如，mRuby2的糟糕表现是由Constantini等人(2015)并通过Bindels等人(2017)但不是通过Cranfill等(2016)）.此外，在OSER检测中良好的性能并不能保证使用这种荧光蛋白来标记感兴趣的蛋白质不会出现问题。
在图1中，我们提供了一个使用一些荧光蛋白的OSER分析的例子。金宝搏app下载CytERM与mTurquoise2和dTomato的融合，分别建立了单体和二聚FPs，作为正确的ER结构的阳性和阴性对照。基于这些数据，我们认为mKOk具有二聚化倾向，不适合用于蛋白质标记。另一方面，mscarlett - i显示了正确的ER标记，这是很好的证据，mscarlett - i作为一个单体在测试的细胞类型。
综上所述，当蛋白质标记是目标时，我们建议您尝试几种不同的荧光蛋白(金宝搏app下载Cranfill et al .， 2016;Constantini等人，2012年）.新融合蛋白的定位和生物学特性可以与已建立的真正单体荧光蛋白mEGFP或mTurquoise2进行比较。金宝搏app下载
结束语
许多荧光蛋金宝搏app下载白是可用的，它们的数量正在稳步增加。当然，您希望为您的研究提供“最新和最好的”变种，具有最好的属性。但请注意，出版物中报道的荧光蛋白只在有限的条金宝搏app下载件下进行表征，通常使用纯化蛋白。因此，在相关条件下验证一些有前景的荧光蛋白的一些关键特性(亮度、光稳定性、低聚化)是非常必要的金宝搏app下载你的研究。
这将揭示荧光蛋白在你的生物系统中的表现，你将使用显微镜。金宝搏app下载如果你做了一个正面的比较，这将是对科学界有价值的信息。收集到的知识和经验可以作为图1的一部分发布，作为预印本上传，或者以其他方式记录。除了数据,新质粒和/或被改造的细胞或有机体可以共享，以简化他人的比较。一起，我们可以建立一个有价值的资源与工具和数据，表明(一组)荧光蛋白在特定条件下的性能。金宝搏app下载
非常感谢我们的客座博主JoachimGoedhart和Marieke Mastop !
Joachim Goedhart是阿姆斯特丹大学分子细胞学和Van Leeuwenhoek高级显微镜中心的助理教授。他开发、表征并使用基因编码的荧光探针。你可以在twitter上关注他:@joachimgoedhart．
Marieke Mastop是阿姆斯特丹大学分子细胞学专业的博士候选人，在那里她开发了基于基因编码的FRET生物传感器。
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