这篇文章是由阿姆斯特丹大学分子细胞学和先进显微镜Van Leeuwenhoek中心的客座博主Joachim Goedhart和Marieke Mastop贡献的。
本系列的前一篇文章描述了a一种选择荧光蛋白的实用方法．在本系列的第二篇文章中，我们将讨论如何选择光稳定剂荧光蛋白．
光漂白是指荧光团在光的影响下发生不可逆的破坏。任何荧光分子在某一时刻都会被光漂白。对于活细胞成像，希望有光稳定的荧光蛋白。金宝搏app下载除了光漂白外，荧光蛋白可能会显示可逆的强度变化(金宝搏app下载Shaner等人，2008年；Bindels等人，2017年）和光电开关(Kremers等人，2009年)，这通常是不需要的属性。在理想的情况下，荧光蛋白应发出稳定的荧光信号，在实验过程中没有或很少出现信号的恶化或变化。
用于活细胞成像的最金宝搏app下载佳荧光蛋白可以被多次激发，从而在它们被破坏之前产生大量的光子。
影响光稳定性的因素
荧光团的光漂白速率主要取决于激发功率和激发波长。当荧光团从峰值波长激发时，它不太可能漂白，因为它吸收激发光的效率较低。同样，降低激发光的功率会减少单位时间内激发/发射周期的数量，从而降低荧光团漂白的可能性。然而，这并不是故事的全部。光漂白速率与激发功率不呈线性关系。这意味着，将功率减少2倍并不会减少一半的光漂白。光漂白率究竟如何依赖于功率是荧光蛋白的一个特性。同一光谱类别的荧光蛋白(金宝搏app下载Cranfill等，2016)．
这种对激发功率的非线性依赖是重要的，因为不同的荧光成像策略使用的激发功率大不相同(Shaner等人，2008年)．在共聚焦激光扫描显微镜中，荧光蛋白被非常强烈的光激发(时间很短)，而在广域成像金宝搏app下载中荧光团被相对较低的光激发(时间很长)。其他的照明策略，如2光子激发、选择性平面照明、TIRF或旋转圆盘共聚焦使用完全不同的激发功率机制。因此，哪一种荧光蛋白在这些条件下最稳定是不可预测的。除了这些因素外，环境条件如细胞氧化还原状态和氧气浓度也可能影响光漂白率(Shaner等人，2008年)．这就给我们带来了一个关键问题:比较不同荧光蛋白的光稳定性最好的方法是什么?金宝搏app下载
耐光性测量
显然，光稳定性荧光蛋白是定量活细胞成像的关键要求，因此能够量化荧光蛋白的光稳定性非常重要。金宝搏app下载为了确定光稳定性，进行了一个实验，测量随时间变化的荧光强度。为了预测荧光团在“真实实验”中的表现，建议在真实条件下，即低激发功率下，对产生感兴趣的荧光蛋白的细胞进行延时成像。通过对不同荧光蛋白重复这些测量，并比较荧光强度随时间的变化，可以直接比较荧光蛋白的光稳定性。金宝搏app下载
一个测量各种光稳定性的例子青色荧光蛋金宝搏app下载白如图1所示。值得注意的是，光漂白率不依赖于荧光强度或蛋白质分布。因此，光稳定性测量可以用可溶性荧光蛋白或局部融合蛋白进行，而不需要专门的质粒或结构。金宝搏app下载
应该注意的是，文献中报道的光稳定性测量是通过不同的方法进行的。我们描述了用于进行这些测量的一些实验设计的一些问题，希望这些信息可以帮助指导您对报告数据的理解。
光漂白导致荧光的损失，在其最简单的形式中，可以用单指数衰变(类似于放射性衰变)来描述。因此，强度衰减通常被描述为t½，这是一段时间后，一半的初始荧光强度仍然存在。第一个问题是，在一些情况下，荧光团的荧光强度衰减并不遵循简单的单指数衰减(Shaner等人，2008年；Bindels等人，2017年）而且不能用单个参数来描述。因此，有必要了解荧光强度随时间的变化。
第二个问题是，在测量光稳定性的实验中，经常使用高激发功率来缩短实验的长度。由于光漂白速率与功率不呈线性关系，因此在高功率下得出的结论可能无法转化为实际应用中使用的功率要少得多。例如，您可能会发现，从您选择的FP中获得有用数据的时间比这些高功率实验所预测的要长得多。在实际功率下测量光稳定性将更好地了解预期应用中的光稳定性(Goedhart等人，2012年)．
第三个问题与荧光蛋白的环境有关。光稳定性测量可以在纯化的荧光蛋白上进行。金宝搏app下载为了避免扩散，蛋白质(i)被困在水/油乳状液的微滴中，(ii)被嵌入凝胶中，或(iii)附着在基质上。这些体外这些方法允许一个控制良好的环境，但它们不能模拟自然环境。测量活细胞的光稳定性提供了一个更真实的光稳定性视图。
选择耐光蛋白
光褪色的问题量化利率可以概括如下:而不是确定t½荧光蛋白的水/油乳剂在高功率,更相关的测量荧光强度的发展随着时间的推移,在活细胞力量用于live-cell成像。
综上所述，在显微镜系统和打算与荧光蛋白一起使用的细胞类型(或组织)中，通过对几个光谱级相同的荧光蛋白进行头对头的比较，可以识别出最稳定的荧光蛋白。金宝搏app下载在图1中，我们提供了一个使用宽场成像的青绿色荧光蛋白之间比较的例子。金宝搏app下载我们选择的可用于活细胞成像的光稳定蛋白是mTurquoise2，根据在低励磁功率下采集的数据。然而，请注意，在14倍高的激发功率下，这些变体的光稳定性是相当的(图1的下面板)。
为了避免励磁功率的变化，在一个稳定的系统上进行单天实验是很重要的。最后一个建议是测量你在成像实验中使用的激发功率。测量励磁功率(Grünwald等，2008年)，特别是在更换了设置(例如更换了坏掉的灯泡或交换了励磁滤波器)之后。这避免了激发功率的实质性变化，将有助于保持探头的光稳定性在检查。
非常感谢我们的客座博主JoachimGoedhart和Marieke Mastop !
约阿希姆Goedhart是阿姆斯特丹大学分子细胞学和Van Leeuwenhoek高级显微镜中心的助理教授。他开发、表征并使用基因编码的荧光探针。你可以在twitter上关注他:@joachimgoedhart．
Marieke Mastop是阿姆斯特丹大学分子细胞学专业的博士候选人，在那里她开发了基于基因编码的FRET生物传感器。
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