选择你的荧光蛋白多色成像金宝搏app下载

这篇文章由加州大学旧金山分校尼康成像中心的库尔特·索恩提供。

活细胞成像实验的一个共同要求是能够同时跟踪多个荧光标记物种。要使用荧光蛋白标签进行标记，需要多个荧光蛋白金宝搏app下载它们的激发光谱和发射光谱足以使它们在显微镜上在不同的荧光通道中成像。近年来随着荧光蛋白的增殖，有许多荧光蛋白组合可以一起金宝搏app下载成像，但这也意味着荧光蛋白的选择需要一些思考。

为你的多色成像实验选择荧光蛋白的第一步是要知道有哪些荧金宝搏app下载光蛋白可用。由于每个月都有新的金宝搏app下载荧光蛋白被公布，为特定的应用选择最佳的蛋白质是一个挑战。为了让大家了解最新的荧光蛋白，我保持金宝搏app下载目前可用的最佳荧光蛋白交互式图表和表格金宝搏app下载．

选择相容的荧光蛋白金宝搏app下载

为了选择一组荧光蛋白一起成像，你需要考金宝搏app下载虑与选择单个荧光蛋白相同的因素(亮度，耐光性，等等;看到之前的博客文章有关这些因素的更多讨论)。此外，您还需要选择可以相互区分的荧光蛋白，并可以用您打算使用的显微镜上的光学成像。金宝搏app下载要准确地确定两个荧光蛋白是否可以彼此分离，需要了解它们的激发和发射光谱，但是金宝搏app下载一个很好的经验法则是，两个蛋白质的峰值激发波长和峰值发射波长都应该相隔50-60 nm。例如，CFP（ex 430 nm/em 474 nm）和YFP（ex 514 nm/em 527 nm）可以一起成像，但CFP和GFP（ex 488 nm/em 507 nm）显示了两种荧光蛋白之间的一些串扰。如果你必须对光谱重叠的荧光蛋白成像，有一些技术，比如光谱分解，可以用来分离荧光蛋白，但这些超出了本文的范围。金宝搏app下载

你的荧光蛋白和你的金宝搏app下载显微镜光学兼容吗?

要确定您感兴趣的荧光蛋白是否与显微镜光学金宝搏app下载系统兼容，您需要将蛋白质的激发光谱和发射光谱与显微镜上的滤光片组或激光进行比较。理想情况下，您希望在激发和发射滤光片与蛋白质的激发和发射光谱之间有实质性的重叠，以便显微镜能够很好地激发蛋白质，并且显微镜能够有效地收集蛋白质的荧光发射。为了比较荧光蛋白和过滤器组之间的匹配，许多过滤器组供应商提供了绘制蛋白质和染料及其过滤器的荧光光谱的工具（参见浓度的，Semrock的,或欧米茄)．虽然它们不包含所有常用的荧光蛋白(尤其是最近发表的那些)，但金宝搏app下载它们可以是一个很好的起点。在许多情况下，如果您知道您感兴趣的蛋白质具有相似的光谱，那么使用与之密切相关的蛋白质的光谱就足够了。例如，这里有一个来自色度光谱查看器的截图，比较了标准Cy3或罗丹明滤镜集(色度#49004)与mCherry和TagRFP的光谱。

这里，TagRFP光谱以较深的颜色显示，mCherry光谱以较浅的颜色显示；激发光谱为蓝色，发射光谱为红色。两者都不是滤波器组的完美匹配，但激励滤波器激发更多的TagRFP激励峰值，且发射滤波器收集的TagRFP发射比mCherry发射更大的一部分。对于这个滤波器组，我们期望TagRFP发出比mCherry更亮的信号。总的来说，为罗丹明/Cy3设计的滤光片组在较短波长的红色荧光蛋白（如TagRFP或mRuby2）上比在较长波长的蛋白（如McHery）上工作得更好。有关荧光和过滤器集的背景信息，请参见金宝搏app下载荧光显微学简介讲座,iBiology．

常用滤光片及相关荧光蛋白金宝搏app下载

常用的多色成像滤光片包括为CFP、YFP和RFP设计的滤光片，或为DAPI /荧光素/罗丹明/ Cy5设计的Sedat Quad滤光片。Semrock的)以及在共焦（405/488/561/640nm）上的类似4-激光组合。在我们手中，使用这套设备成像的最佳荧光蛋白是mTagBFP2、EGFP或一种改进的GFP变体，mRuby2或TAGFP-T，以及红外金宝搏app下载荧光蛋白，如iFP1.4或iFP2.0。注意这些红外荧光蛋白需要胆绿素作为辅助因子，因此你可能需要用胆绿素补充细胞以获得最大亮度。在哺乳动物细胞中，一种改良的EGFP折叠变体如Memerad或Clover可能是最好的；mNeonGreen是一种更新的绿色荧光蛋白，被认为是非常明亮的。在里面酿酒酵母，我们已经用这个过滤器测试了许多绿色和红色荧光蛋白，并且金宝搏app下载亮度测量报告．在这里，EGFP的性能优于改进的折叠变体，可能是由于较低的生长温度。然而，这也表明，没有一种荧光蛋白最适合所有生物体，如果你想要最亮的信号，你可能需要尝试你的系统中感兴趣的几种蛋白质。最后，在这组蛋白质中，绿色和红色的蛋白质通常是最容易检测到的，所以应该用来标记含量最少的蛋白质，蓝色和红外通道用于含量更多的蛋白质或标记隔间。

我希望这能为荧光蛋白的多色成像提供一些线索。有了正确的显微镜和荧光蛋白的正确选择，同时成像四种颜色应该是非常简单金宝搏app下载的。

感谢我们的客座博主!

库尔特·索恩（Kurt Thorn）是加州大学旧金山分校（UCSF）的副教授，负责尼康成像中心的工作。他在Ronald Vale实验室获得加州大学旧金山分校生物物理学博士学位，之后成为哈佛大学鲍尔基因组研究中心研究员。了解更多信息，请访问他的实验室网页或他的显微镜博客．