CRISPR / CAS9的组件

更新了Mar 26,2020。

在最基本的层面上，CRISPR / Cas9基因组编辑系统使用非特异性核酸内切酶(Cas9或密切相关)CPF1）切割基因组和小RNA（GRNA）以将该核酸酶引导至用户定义的切割部位。在阅读这篇文章后，我们希望您将赶上大部分主要的Crispr Lingo，并能够描述各种CRISPR / CAS9组件的功能。请注意，虽然此帖子旨在提供CRISPR组件的一般概述，但正在发现新的CAS9变体，并且这些不同系统的要求可能会有所不同（例如，XCAS9是一种随着PAM Flexibiliy增加的变体和eSpCas9/SpCas9-HF1具有更高的靶向特异性）。

Cas9核酸内切酶的功能

而原生CRISPR/Cas系统有多种负责处理外源DNA的酶以及内切酶功能所需的RNA向导，当使用时基因组工程在美国，唯一需要的CRISPR蛋白是Cas9内切酶或其变体。这个单独的蛋白质有所有必需的成分:

1.绑定到导向RNA

引导RNA使Cas9能够切割许多可能位点的特定基因组位点，下面将对此进行更详细的描述。如果不与引导RNA结合，Cas9就不能切割。

2.在引导RNA存在下结合靶DNA，条件是靶是相邻基序（PAM）的原始晶圆的上游（5'）

Cas9内切核酸酶与靶基因组轨迹的结合是通过引导RNA内含有的靶序列和称为3碱对序列的靶序列介导的Protospacer相邻的主题或帕姆．为了让dsDNA被Cas9剪切，它必须包含一个紧靠引导RNA靶点下游(3 ')的PAM序列。在没有引导RNA或PAM序列的情况下，Cas9既不能结合靶标也不能切割靶标。来自不同生物体的Cas9同源物或在各种实验室中开发的Cas9突变体(见下表)有不同的PAM要求。这些不同的PAM要求允许研究人员针对许多不同的基因组位点。

3.切割靶DNA导致双链断裂（DSB）

Cas9及其变体有两个内切酶结构域:n端ruvc样核酸结构域和靠近蛋白中心的hnh样核酸结构域。在目标结合时，Cas9经历构象变化，定位核酸酶结构域以切割目标DNA的相反链。因此，cas9介导的DNA损伤的最终结果是在PAM序列上游的靶DNA ~3-4核苷酸内出现一个DSB。

Cas9物种/变异和PAM序列

合成引导RNA或gRNA(有时是sgRNA)

在天然的II型CRISPR/Cas系统中，Cas9在两种rna的帮助下被引导到其靶位点:theCRRNA它定义了Cas9的基因组靶标，而tracrrna.它作为将CRRNA连接到CAS9的脚手架，并促进来自衍生自CRISPR阵列的CRRNA的成熟CRRNA的处理。在用于CRISPR介导的基因组编辑的大多数系统中，这两个小RNA已被冷凝成一个称为引导RNA（GRNA）或单引导RNA（SGRNA）的RNA序列。在这篇文章的剩余时间内，我们将此RNA复合物称为“GRNA”。GRNA含有20个核苷酸靶序列，以将CAS9直接至特定基因组基因座和Cas9结合所需的支架序列。当使用CRISPR / CAS9用于基因组编辑时，研究人员只需表达一个旨在将CAS9指定到其目标选择序列的GRNA（参见小贴士设计GRNA)和他们的偏好Cas9 Variant.(以适当的PAM序列)来修改所需的基因组位点。

一些历史记录

细菌基因组中的CRISPR序列由独特序列分隔的重复元件组成。当研究人员第一次发现这些数组时，他们并不知道它们的功能，只是简单地把重复的元素称为“直接重复”，把它们之间独特的DNA延伸称为“间隔”(见下图)。

经过多年的研究，我们现在知道，每个直接重复，结合其相邻的间隔，最终编码一个单一的crRNA。直接重复区域包含将pre-crRNA加工成成熟crRNA和tracrRNA结合所需的序列。另一方面，间隔区是每个crRNA特有的外来DNA靶序列。

底线，与tracrRNA组合的“直接重复区域”形成GRNA的支架部分，“间隔区”形成靶序列。

天然CRISPR阵列及其裂解外源DNA的过程综述。A)在细菌基因组中发现的CRISPR序列被转录为包含间隔区和直接重复区的pre- crrna。B) RNase III，即tracrRNA和Cas9，结合到这些转录本上;C)切割它们，留下成熟的crrna结合到Cas9/tracrRNA复合物上。D)成熟的crRNA用于引导Cas9复合物到目标DNA, E)裂解，留下一个F)双链断裂。gRNA是研究人员设计的tracrRNA和crRNA的杂交体。与tracrRNA结合的“直接重复区域”形成gRNA的支架部分，“间隔区域”形成靶序列。

既然你知道关于CRISPR的所有不同组件，现在是时候开始考虑如何在实验中使用它们了。使用以下流程图来让您考虑您正在进行的实验类型并阅读电子书或浏览我们的CRISPR资源充实你的计划。

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