利用新的全基因组CRISPR筛选设计控制脱靶效应

全基因组CRISPR / Cas9屏幕是一种高通量的系统方法，用于识别参与生物过程的基因。这些筛选提供了全基因组RNAi筛选的另一种选择，后者虽然非常有效，但受低靶上疗效、非特异性毒性和脱靶效应的影响。RNAi筛管的缺陷被很好的描述，并且存在控制这些缺陷的策略。然而，目前还不清楚CRISPR屏幕是否存在类似的缺陷，以及如何最好地设计这些屏幕来控制缺陷。最近,Bassik实验室在斯坦福大学开发了新的全基因组CRISPR敲除筛选分析以下关于CRISPR筛选设计未回答的问题。

关于全基因组CRISPR/Cas9筛选设计的未解问题

• 非靶向指南是适当的控制吗?许多CRISPR筛选使用非靶向指南作为阴性对照。非靶向指南不针对基因组中的任何位点。这意味着，虽然它们控制了gRNA和Cas9表达的许多影响，但它们不能解释Cas9诱导的dsDNA断裂的影响。
• 全基因组筛查中的脱靶切割模式与单指南研究中的模式相似吗?有许多策略可以减少Cas9脱靶效应，但大多数研究只关注少数指南的偏离目标的删减。目前还不清楚脱靶剪切是否会干扰高通量CRISPR筛选的结果。
• 短导管(17-18 bp)比全长导管(19-20bp)有更少的脱靶切割吗?小规模的研究(蔡等．，傅等．)表明17-19 bp长的引导基因在不降低靶上活性的情况下减少了脱靶切割，但目前还不清楚这是否适用于全基因组筛查。

Bassik实验室的CRISPR敲除文库

图书馆的概述

为了更好地确定CRISPR敲除筛选的最佳条件，Bassik实验室创建了一个人类敲除文库，每个基因有10个gRNAs，并针对所有~ 20500个蛋白编码基因。在选择指南时，针对基因组中独特的、非重叠的位点，预测的靶上活性与预测的脱靶活性相平衡。导游是作为一个集中库通过一个慢病毒载体到稳定表达Cas9或被Cas9慢病毒感染的细胞系。

验证库

CRISPR基因敲除文库通过生长筛选和蓖麻毒蛋白毒性筛选，因为这两种途径的必需和非必需基因之前已经被确定(哈特等人,Bassik等）.该文库在两种筛选中表现良好，生长筛选的错误发现率为1%，识别了之前识别的必要基因的>88%，而之前的Cas9和shRNA筛选仅识别了60%的必要基因。蓖麻毒素毒性筛选有10%的错误发现率，并鉴定出67%的先前鉴定的蓖麻毒素毒性基因。这项筛选还发现了几个以前与蓖麻毒素调节无关的基因，包括几乎所有参与生成细胞表面聚糖的基因，而这种聚糖是蓖麻毒素摄取所必需的。蓖麻毒素筛查确实未能识别出一些已知的蓖麻毒素调节基因，但这些基因中的大多数对生长也是必不可少的，预计不会在CRISPR敲除筛查中被识别出来。

改进CRISPR敲除筛选的设计

在深入研究结果之前，重要的是要注意，在Morgens等人的研究中，指南被认为是有毒的，如果它们从屏幕上被耗尽。这种毒性被用于检测Cas9切割。

安全靶向指南比非靶向指南更好地控制非特异性毒性

首先，Morgens等人研究了安全定向指南与非定向指南对屏幕分析和呼叫的影响。图书馆共收录非靶向指南5644份，安全靶向指南6750份。安全靶向指南被设计用于靶向没有注释功能的基因组位点，例如缺乏开放染色质标记、dna酶超敏反应或位于增强子、转录因子结合位点或编码区域的位点。针对这些位点应控制引导表达和dsDNA断裂的影响。

在生长筛选中，安全靶向指南比非靶向指南耗竭的速度更快，这表明安全靶向指南比非靶向指南毒性更大。毒性可能是由于DNA损伤及其随后的修复。此外，安全靶向指南富集和损耗分数的分布更接近于基因靶向指南的分布，这表明安全靶向指南更好地控制由CRISPR引起的dsDNA断裂的固有效应或背景噪声。有关更多细节，请参见补充图6。

安全瞄准指南也改变了从生长和蓖麻毒素筛选中发现的命中。当使用安全靶向指南从增长屏幕调用点击时，p值的重要性低于使用非靶向指南作为控制项时。不那么重要的p值会导致更多的假阴性结果(即无法识别一个热门基因);但它们也会导致更少的假阳性结果(即错误地称一个基因是命中的，而实际上不是)。在实践中，这意味着使用安全靶向指南作为对照将导致比使用非靶向指南更少的真实阳性命中，而非靶向指南使用相同的错误发现率下限进行分析。

与使用非靶向指南作为对照的结果相比，在CRISPR文库中添加安全靶向指南会导致已知蓖麻毒素调控基因的p值增加或降低。虽然目前还不清楚安全靶向指南将如何影响所有非生长筛选中的表型，但这些结果表明，安全靶向指南可能比非靶向指南作为更好的控制，并可能更准确地确定非生长筛选中命中的重要性。

离靶切割不会混淆CRISPR筛选的结果

接下来，对脱靶位点引导物的毒性进行了分析。精确或1 bp错配脱靶指南比零错配脱靶指南毒性更大。2 bp失配脱靶指南只有在5+脱靶位点时才有毒性。筛选结果也重现了之前观察到的影响gRNA脱靶活性的几个特征:1)离PAM更近的错配比离PAM更远的错配更少耐受，2)GC含量高的导联有更大的脱靶活性。

与全长grna相比，短grna具有较低的脱靶切割和类似的靶向切割

最后，利用全长度(19-20 bp)和短长度(17-18 bp)的导引头探讨了导引头长度对靶外切割的影响。当比较具有1-bp错配脱靶位点的导板的毒性时，短导板比全长导板的毒性更小。短指南的毒性降低可能是由于较低的脱靶活性，但也可能是由于靶上活性的降低。然而，短导和长导蓖麻毒素敏化剂基因损耗无显著差异。综合这些结果表明，短指南比长指南有更少的脱靶效果，并且没有显著降低靶上疗效。

Morgens等人的研究结果表明，全基因组CRISPR筛选容易出现与RNAi筛选相同的缺陷，例如由于靶上和靶外效应而产生的非特异性毒性，但也提出了一种控制这些效应的策略。通过测试成千上万的脱靶活性指南，Morgens等人得出了一些关于脱靶活性的一般化结论，证明了安全靶向指南作为一个潜在的对照，并提供了证据，证明截断的grna在高通量筛选中只有少量的靶向活性损失，但提高了特异性。的人类和鼠标Bassik CRISPR敲除文库的版本可以从Addgene获得!

参考文献

1.Morgens, David W.等。“在高通量筛选中使用Cas9毒性对脱靶活性的基因组尺度测量。”自然通讯8(2017): 15178。PubmedPMID:28474669．公共医学中心PMCID: PMC5424143．

2.蔡胜达，等。GUIDE-seq使CRISPR-Cas核酸酶的脱靶切割全基因组分析成为可能。自然生物技术33.2(2015): 187。PubmedPMID: 25513782．公共医学中心PMCID: PMC4320685．

3.付艳芳，等。“利用截断的引导rna改善CRISPR-Cas核酸酶特异性。”自然生物技术32.3(2014):279。PubmedPMID: 24463574．公共医学中心PMCID:PMC3988262．

4.哈特，特拉弗等人。“测量基因组干扰筛检的错误率:人类功能基因组学的黄金标准。”分子系统生物学107(2014):733。PubmedPMID:23394947．公共医学中心PMCID: 4299491．

5.Michael C. Bassik等。“一份系统的哺乳动物遗传相互作用图揭示了蓖麻毒素易感性的潜在途径。”Cell 152.4(2013): 909-922。PubmedPMID: 23394947．公共医学中心PMCID: 3652613．

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