Cpf1: CRISPR基因组编辑的新工具

2020年8月13日更新。

注:Cpf1也称为Cas12a。

2015年，Zetsche et al。在CRISPR的工具箱中添加了两个特征Cpf1在哺乳动物细胞中显示卵裂活动的直系细胞。与Cas9核酸酶一样，Cpf1家族成员也含有一个类似ruvc的核酸内切酶结构域，但缺少Cas9的第二个HNH核酸内切酶结构域。Cpf1以交错模式切割DNA，只需要一个RNA，而不是Cas9需要的两个RNA (tracrRNA和crRNA)进行切割。在某些情况下，Cpf1可能比Cas9更适合基因组编辑-继续阅读了解更多关于Cpf1，并查看我们的CRISPR指南用于进修Crispr / Cas9。

Cpf1是如何被发现和测试的?

2类CRISPR系统，包括基于II型CAS9的系统，需要单组分核酸酶来介导裂解而不是第1类系统所采用的多亚基复合物。推定的新级2核酸酶，CPF1（Crispr来自普氏菌和弗朗西斯氏菌属），在若干基因组中注释，被归类为V型CRISPR系统。与CAS9一样，CPF1含有一种类似RUVC的内切​​核酸酶域，但它缺乏CAS9的其他HNH内核酸酶域，表明CPF1功能不同。由于CPF1基因座广泛分布在细菌物种上，Zetsche等人。假设CPF1可能代表功能性CRISPR核酸酶，其可以适用于基因组编辑。使用不同的核酸酶可能会克服Cas9的一些缺点 - 即它的钝双链切割和富含G的PAM要求。

Zetsche等人从第一步开始对Cpf1核酸酶进行表征。使用弗朗西斯氏菌属cpf1（FNCPF1），他们雇用了一个大肠杆菌质粒耗尽测定发现FNCPF1PAM序列要求。Cpf1与Cas9 (3 ' -NGG)在基因组定位和gc含量上均不同，其PAM为5 ' -TTN。在测序和寻找对Cpf1功能重要的细胞rna后，他们发现Cpf1介导的成熟crrna长度为42-44个核苷酸，与Cas9的大小相同，但直接重复在间隔序列之前而不是之后。Cpf1 crRNA的结构也比Cas9的简单得多;在直接重复区域只有一个短的茎环结构是分裂目标所必需的。Cpf1也不需要额外的tracrRNA。

一旦他们确定了CRISPR-Cpf1的最小元素，Zetsche等人就开始研究其裂解模式。他们又一次遇到了惊喜!Cas9在PAM位点上游3处产生钝端，Cpf1以交错方式切割，在离PAM远的地方产生一个5′18-23个碱基。有了这些信息，他们转向细胞培养系统，看看是否会出现Cpf1核酸酶在活的有机体内哺乳动物细胞的活动。从16个不同的Cpf1候选人，Zetscheet al。发现两者，显示与Cas9类似的稳健切割活动。这两种核酸酶，AsCpf1和LBCPF1(分别为1307和1228个氨基酸)，它们都以类似FnCpf1的交错模式分裂。

CPF1在Cas9上的潜在优势

基于Cas9的II型CRISPR系统被认为是最简单的CRISPR系统，最容易适应基因组编辑，但V型cpf1驱动系统的引入为CRISPR工具箱增加了另一个选项。Cpf1的交错切割模式为定向基因转移开辟了可能，类似于传统的限制性内切酶克隆。粘端介导的基因转移将特别有助于靶向不易被修饰的非分裂细胞homology-directed修复(HDR)．Cpf1还将CRISPR可定位的位点数量扩大到AT-rich区域或缺少SpCas9青睐的3 ' -NGG PAM位点的AT-rich基因组。

由于CPF1不需要TRACRRNA，因此CRRNA引导率仅为〜42 nt。这些CRRNA的直接合成应比CAS9功能所需的〜100nt CRRNA / TRACRNA混合引导率明显便宜。由于CPF1及其指南RNA都小于SPCAS9对应物，因此它们也将更容易地提供低容量向量，例如adeno相关病毒（AAV）向量．2017年，Zetsche et al。开发了一个Cpf1多路复用的方法使用一个crRNA阵列来表达多达4个crRNA。

Zetsche et al。还表明CPF1可以提高HDR的频率非同源endjoining（nhej）．cas9介导的NHEJ通常会破坏PAM位点，因为它靠近卵裂位点，阻止了未来的编辑。相反，由于Cpf1裂解距离PAM相对较远，NHEJ可能保留PAM位点。因此，如果Cpf1介导的裂解后HDR没有发生，那么PAM的持续存在可能会使Cpf1有再次裂解的能力，并可能介导HDR。这种“第二次机会”机制可能会提高所需HDR编辑的频率，但这种可能性尚未得到实验证实。为了防止hdr后的新编辑，修复模板应该删除PAM序列。

比较CPF1和CAS9以目标和脱靶效率

当第一次确定CPF1时，我们对其目标和非目标编辑效率不太了解。金等。和Kleinstiver等．特征在于已知在哺乳动物细胞，LBCPF1和ASCPF1中有活性的两种CPF1矫正效率的基因组宽编辑效率。在两个报告中，CPF1 Orthologs的目标编辑效率仅略低于广泛使用的SPCAS9并与SACAS9相媲美。如Cas9 Orthologs所示，CPF1效率随GRNA序列而变化很大。

这两个组都使用多种方法来检查CPF1脱机目标编辑。首先，它们设计了在23碱基序列中具有单一的单一不匹配的GRNA。双重错配烧蚀CPF1活动，除非存在于目标序列的3'末端（Bases 19-23）中。CPF1对单一不匹配也敏感，但可变，因此，Kleinstiver等人。报告CPF1可以耐受GRNA位置1,8,9和19-23的不匹配。因此，GRNA靶序列的3'末端在CPF1介导的编辑中没有必要的功能，如Kleinstiver等人。在目标序列的3'末端，在4-6个基础缺失中看到CPF1活性的降低。

Cpf1的优势可能在于它的低脱靶编辑率，这是由复杂的全基因组分析确定的。在许多计算预测的脱靶位点，Cpf1不介导可检测的脱靶裂解。大多数grna在1-12个脱靶位点上进行低频裂解;相反，根据Kim等人的研究，SpCas9可能在大约90个位点发生裂解。Kim等人还比较了AsCpf1和LbCpf1的总脱靶与靶上修饰的比例，发现两者的脱靶活性均低于之前观察到的SpCas9。kleinstver等人认为AsCpf1的脱靶率与高保真Cas9s相似ESPCAS9和SPCAS9-HF1．ascpf1和lbcpf1核糖核蛋白(RNPs)未能在细胞培养模型中诱导脱靶编辑。

Cpf1在基因组编辑中的应用在基础科学和翻译应用方面都是令人兴奋的。这种V型CRISPR系统的发现证明了我们对CRISPR生物学还有很多需要了解的。后来的作品，喜欢改编Cas13到RNA靶向和RNA编辑，进一步显示了基于crispr的系统的多样性。

参考文献

1. Zetsche，Bernd等人。“CPF1是2类CRAP-CAS系统的单一RNA引导的内切核酸酶。”细胞（2015）．PubMedPMID: 26422227．

• 从本出版物中找到质粒在Addgene。

2. Zetsche，Bernd等人。“使用单个CRRNA阵列通过CRISPR-CPF1编辑的多重基因编辑。”NAT BIOTECHNOL。35.1(2016): 31-34。PubMedPMID: 27918548。

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Kim，Daesik等人。基因组的分析显示人细胞中CPF1内切核酸酶的特异性。NAT BIOTECHNOL。(2016)．PubMedPMID: 27272384

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作者:Benjamin P. kleinstver等。CRISPR-Cas Cpf1核酸酶在人类细胞中的全基因组特异性NAT BIOTECHNOL。(2016)．PubMedPMID：27347757．

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Makarova, Kira S.等。“CRISPR-Cas系统的最新进化分类。”NAT Rev Microbiol。（2015）．PubMedPMID：26411297．

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