注:Cpf1也称为Cas12a。
在2015年,冯张的实验室描述了两个Cpf1核酸酶，这是众所周知的Cas9的远亲。Cpf1以交错模式切割DNA，只需要一个RNA，而不是Cas9需要的两个RNA (tracrRNA和crRNA)进行切割。现在，两项新的研究表明，Cpf1显示出比Cas9更低的脱靶编辑，这证实了这种蛋白质非常适合基因组编辑。
Cpf1的潜在优势
基于Cas9的II型CRISPR系统被认为是最简单的CRISPR系统，也是最容易适应基因组编辑的CRISPR系统V型cpf1驱动系统在CRISPR工具箱中增加了另一个选项。当Cpf1首次被发现时，研究人员想知道它是否能克服Cas9的一些缺点。Cpf1的PAM为5′-TTN，而Cpf1的PAM为5′-TTNCas9 -NGG (3)在分布和gc含量上，这可能会改善at丰富基因组的编辑。此外，Cas9在PAM位点上游3处产生钝端，而Cpf1以交错方式切割，在离PAM远的地方产生一个5′18-23个碱基。Cpf1的交错卵裂模式开辟了类似于传统定向基因转移的可能性限制性内切酶克隆．粘端介导的基因转移将特别有助于靶向非分裂细胞，这些细胞很难通过同源性修复来修饰。
Cpf1和它的引导rna都比SpCas9小，所以它们更容易在低容量的载体中传播，比如AAV．AAV(腺相关病毒载体)由于其低免疫原性和多188完整比分直播种血清型可优先感染某些组织，常被用于体内基因传递。然而，这些载体的遗传容量只有4.5 kb左右。在4.1 kb处，当添加gRNA和调控元件时，SpCas9几乎不适合AAV。为了解决这个问题，张实验室以前使用过SaCas9 (1053aa /3.2 kb)带有AAV载体有效的产后编辑。LbCpf1和AsCpf1的长度分别大于3.7 kb和3.9 kbSaCas9但比SpCas9小。这些核酸酶应该很好地适合于AAV载体，特别是考虑到Cpf1的gRNAs也比Cas9所需的短(42 nt vs 100 nt)NgAgo比这些选项中的任何一个都小(2.7 kb, 24 nt指南)，因此它有可能在基于aav的应用中超过任何CRISPR核酸酶。
本帖所讨论的NgAgo文章的原稿已被撤回跟踪研究未能证明用这个工具进行基因组编辑
Cas9和Cpf1对靶和脱靶编辑效率
直到最近，Cpf1的两个主要特征元素仍然缺失:靶上和靶外编辑效率。金等。和Kleinstiver等．LbCpf1和AsCpf1这两个在哺乳动物细胞中活跃的同源基因的全基因组编辑效率。在这两篇报道中，Cpf1同源基因的靶标编辑效率仅略低于广泛使用的SpCas9，与SaCas9相当。从Cas9同源分析中可以看出，Cpf1的效率随gRNA序列的变化而变化很大。
两组都使用多种方法检查Cpf1脱靶编辑。首先，他们设计了整个23碱基序列单配和双配不匹配的grna。双错配使Cpf1活性减弱，除非它们出现在靶序列的3 '端(碱基19-23)。Cpf1对单个失配也很敏感，但也有不同程度的敏感，kleinstver等报道Cpf1可以容忍gRNA位置1、8、9和19-23的失配。因此，gRNA靶序列的3 '端在Cpf1介导的编辑中不具有必要的功能，如kleinstver等发现靶序列3 '端4-6个碱基缺失，Cpf1活性没有降低。
Cpf1的优势可能在于它的低脱靶编辑率，这是由复杂的全基因组分析确定的。在许多计算预测的脱靶位点，Cpf1不介导可检测的脱靶裂解。大多数grna在1-12个脱靶位点上进行低频裂解;相反，根据Kim等人的研究，SpCas9可能在大约90个位点发生裂解。Kim等人还比较了AsCpf1和LbCpf1的总脱靶与靶上修饰的比例，发现两者的脱靶活性均低于之前观察到的SpCas9。kleinstver等人认为AsCpf1的脱靶率与高保真Cas9s相似eSpCas9和SpCas9-HF1．AsCpf1和LbCpf1核糖核蛋白(RNPs)未能在细胞培养模型中诱导脱靶编辑。
关于Cpf1我们还有什么不知道的
在他们描述Cpf1的原始论文中，Zetsche et al。提示Cpf1可改善homology-directed修复(HDR)在异源endjoining (NHEJ)．cas9介导的NHEJ通常会破坏PAM位点，因为它靠近卵裂位点，阻止了未来的编辑。相反，由于Cpf1裂解距离PAM相对较远，NHEJ可能保留PAM位点。因此，如果HDR在Cpf1介导的切割后没有最初发生，那么PAM的持续存在可能会使Cpf1具有再次切割的能力，并可能以“二次机会”机制介导HDR。为了防止hdr后的新编辑，修复模板应该删除PAM序列。
许多研究和临床应用需要HDR而不是NHEJ，因此比较CRISPR核酸酶和NgAgo之间的HDR效率是该领域的重要下一步。根据我们现在所知道的，Cpf1可能是HDR的最佳选择，但这种可能性还没有被实验证实。研究人员还没有确定由cpf1产生的悬垂介导的潜在“粘端”转基因插入。探索这两个过程的效率将帮助我们更好地理解Cpf1在基因组编辑领域中的位置。
参考文献
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- 从本出版物中找到质粒在Addgene。
2.作者:Benjamin P. kleinstver等。CRISPR-Cas Cpf1核酸酶在人类细胞中的全基因组特异性自然生物技术(2016)．PubMedPMID: 27347757．
- 从本出版物中找到质粒在Addgene。
3.Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, jyoung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F. Cpf1是一个2类CRISPR-Cas系统的单个rna引导内切酶。2015年9月23日。pii: s0092 - 8674(15) 01200 - 3。doi: 10.1016 / j.cell.2015.09.038。PubMedPMID: 26422227
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4.Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, Barrangou R, brons SJ, Charpentier E, Haft DH, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Terns RM, Terns MP, White MF, Yakunin AF, Garrett RA, van der Oost J, Backofen R, Koonin EV。CRISPR-Cas系统的最新进化分类。
5.2015年9月28日。doi: 10.1038 / nrmicro3569。PubMedPMID: 26411297
参考资料在Addgene博客188博金宝官网
- 赶上你的Cpf1背景
- 读到CRISPR竞争者NgAgo
- 学习如何piggyBac载体可以用于基因组编辑吗
在Addgene.org上的资源
- 看看我们CRISPR引导页
- 看看来自杜德纳实验室的帕戈
- 找到验证gRNAs
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