通过突变两个Cas9核酸酶域中的一个，研究人员创造了CRISPR-nickase。Nickas产生单链而不是双链断裂，当与两个相邻的GRNA一起使用时，可以降低偏离目标编辑的概率。在这篇文章中，我们将总结IDT（集成DNA技术）如何首次证明CRISPR Nickas是如何改进的同源定向修复价格，并分享他们为你的下一次CRISPR nickase实验设计规则
Cas9-nickase综述
在这篇文章中，我们将使用SpCas9 nickases作为例子。D10A突变使RuvC结构域失活，因此这个nickase只切割目标链。相反，HNH结构域的H840A突变会产生一个非目标链切割镍酶。不用WT Cas9和一个gRNA直接切割两条链，你可以使用一个Cas9 nickase和两个gRNA创建一个交错切割。
对于nickase应用程序，一个常见的问题是：GRNA应该如何相互定位？gRNAs必须针对不同的链来创建DSB，但这可以通过PAM in或PAM out定向来实现。正如名称所暗示的，PAM OUT设计在目标区域的极端具有PAM序列，而PAM在设计中将目标放置在目标区域的中间，如下图所示。
为了确定最佳nickase设计，IDT科学家Mollie Schubert和Shuqi Yan设计了实验，用HEK293细胞测试nickase偏好。他们首先比较了D10A和H840A在PAM in和PAM out配置中不同刻痕距离（40-130 nt）的总编辑效率。从这些结果可以明显看出，PAM out配置中的编辑要高得多。此外，D10A的编辑效率始终高于H840A，尤其是在切口距离较小的情况下。使用D10A，他们随后表明，当GRNA太近（7-23 nt缺口距离）时，编辑效率非常低。
D10A和H840A都是强大的编辑器，但它们的indel配置文件各不相同。在PAM out配置中，D10A倾向于生成小的删除，而H840A倾向于大的插入。这些剖面可能是由于Nickas产生的不同悬挑模式造成的；D10A在PAM out设计中创建5'悬挑，H840A创建3'悬挑。
探索镍基同源定向修复
使用Nickas治疗癌症的潜在益处HDR目标范围：使用单个gRNA和WT Cas9，修复水平从切口处迅速下降10 bp．所以如果你不能找到一个好的gRNA在靠近插入位点的地方，你就不能获得高的HDR效率。尼克斯造成了交错的割伤——这个系统能在尼克斯之间的整个区域进行修复吗?为了找到答案，Schubert和Yan设计了一个pamout nickase实验，使用单链寡核苷酸(ssODN)供体插入EcoRI位点。使用D10A镍基酶在镍基之间的不同位置插入一个EcoRI位点，他们观察到>20%的修复(最大27%)，通过使用具有40 bp同源臂的上链或下链ssODN供体在51 nt区域。HDR的效率优于使用WT Cas9与左侧gRNA穿过窗口。在随后的实验中，他们也能够使用具有100 nt同源臂的IDT Megamer长ssDNA引入更长的插入(mCherry)。
舒伯特和杨接着研究了一种被认为不适合HDR的情况。在AAVS1而离靶位点最近的两个grna的切割位点距离靶位点为12 nt和13 nt，而不是最佳的<10 nt距离。利用两个离靶点较远的gRNA位点，他们设计了一种D10A nickase策略(46 nt nick distance, pamout)，看看能否解决这个问题。D10A nickase在很大程度上优于两个WT Cas9位点，表现出>20%的修复效率。显然，镍酶策略可以扩大靶向区域，这在没有接近预期突变位点的有效引导时尤其有用。
nickase设计的快速提示
准备好为下一个CRISPR实验使用Nickas了吗？以下是IDT的最佳建议：
- 使用PAM out配置
- 优化你的间距
- D10A:划痕部位间隔37- 68bp
- H840A：缺口部位被51-68 bp隔开
- 将D10A用于HDR
- 将预期插入件放置在缺口位置之间
- 对小的插入或标签使用40 nt同源臂(ssODN;IDT片剂®寡核苷酸）
- 对于大的插入(长ssDNA;IDT Megamer®ssDNA片段）
- 测试底部和顶部链ssDNA供体(如果可能)
本文中的文本和图像改编自IDT网络研讨会：在基因组编辑中使用Cas9 Nickas的优化方法。有关更多信息和存档网络研讨会的链接，点击这里．我们要感谢IDT科学家Mollie Schubert和Shuqi Yan对这篇博文的评论。
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