本文由宾夕法尼亚州立大学富布赖特访问学者Kutubuddin Molla撰稿。
假设你正在处理一个有缺陷的基因Xm，它的序列与正确的基因Xw完全相同，除了一个碱基。如果你听说过CRISPR，你可能会想到一个问题:CRISPR能精确地固定有缺陷的碱基吗?
直到2016年，精确的单碱基变化只有通过利用同源定向修复(HDR)途径它以低频率发生在细胞中，依赖于供体DNA的高效传递来促进修复。自从crispr介导的碱基编辑在美国，这类修复工作现在可以比以前更有效地进行。碱基编辑器精确地改变单个碱基的效率通常在25-75%之间，而通过HDR精确改变的成功率限制在0-5%。这篇博文简要回顾了不同的基本BE技术及其对植物基因组编辑的适应性。胞嘧啶碱基编辑器
2016年，基因组的精确和高效的碱基重写成为可能，两个独立的组(Komor等人，2016年和Nishida等人，2016）通过将胞嘧啶脱氨酶与Cas9 nickase (nCas9)连接，发明了crispr碱基编辑器。nCas9通过切割单链在DNA上产生一个缺口，极大地降低了有害indel形成的可能性。与DNA结合后，CBE将目标胞嘧啶(C)脱氨成尿嘧啶(U)基。后,合成U-G一对是由细胞修复错配修复机械制造一对原来的c g转换为一或恢复到原来的c g基地切除修复由尿嘧啶糖基化酶(图1)。尿嘧啶糖基化酶抑制剂的存在(UGI)最小化第二个结果,增加的生成所需的T-A碱基对。
腺嘌呤碱基编辑器
如果你有另一个基因Y，它有一个有缺陷的等位基因Ym，你需要把一个腺嘌呤(a)转化成鸟嘌呤(G)?您可能想知道CRISPR-base编辑器是否可以执行此更改。然而，没有自然已知的“DNA腺苷脱氨酶”，理论上会产生腺嘌呤碱基编辑器。
一个巨大的蛋白质工程Gaudelli et al。结果成功进化出一种腺苷脱氨酶，它可以作用于DNA进行腺嘌呤碱基编辑。他们首先创造出一种有缺陷的氯霉素抗性基因(CamR)，通过引入点突变(H193Y)。腺嘌呤碱基编辑器对这种突变的逆转将恢复抗生素耐药性。为了找到这种蛋白质，他们创建了一个突变文库大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶(ecada)，与dCas9融合，转化为大肠杆菌隐藏有缺陷的凸轮R基因。对存活下来的菌落的筛选和随后的几轮进化和工程产生了一个突变的TadA (TadA*)，它满意地接受DNA作为它的底物(见图2)。
这种人工进化的腺苷脱氨酶催化目标“a”转化为“I”(肌苷)，而肌苷被细胞聚合酶视为“G”。随后，原始基因组a - t碱基对转化为G-C对(图1)。由于细胞肌苷切除修复不像尿嘧啶切除那么活跃，ABE不需要任何额外的抑制蛋白，如CBE中的UGI。
植物基因组的碱基编辑器
这些初步研究证明了在哺乳动物中碱基编辑的成功，但在植物系统中缺乏碱基编辑器。因此,杨实验室宾夕法尼亚州立大学(PSU)正在适应和改进植物系统的基础编辑平台。
植物腺嘌呤碱基编辑器
我们开发了植物腺嘌呤碱基编辑器(ABE)载体，将A>G或T>C突变植入植物基因组。我们构建了三个版本的载体(pKABE6.3、pKABE7.9和pKABE7.10)，以便用户可以根据‘A’相对于原间隔邻近基序(PAM)的位置优化碱基编辑效率。abie7.10可以编辑目标'A'，如果它位于一个小的基因组窗口:在原间隔体位置4-8，将' NGG ' PAM计算为21-23(图3)。如果目标'A'更接近PAM，即，在原间隔体位置8-10,abie6.3或abie7.9更适合(高德利等人，2017年）．向量有两个Bsa在pol-III (OsU3)启动子驱动的表达系统中克隆单个引导RNA (protospacer+scaffold)。我们用一个多顺反子tRNA-gRNA (PTG)基因系统克隆多个原间隔体，使我们能够同时瞄准多个基因组位点。
这些二元载体可以用来生成稳定的基因组编辑植物农杆菌属介导的转换。我们还构建了适用于原生质体转化的瞬时测定的较小的载体。
植物胞嘧啶碱基编辑器
工厂系统有几种可用的cbe。基于救援对象(CBE-2)- - -基于rAPOBEC (CBE-1)- CBEs在水稻、番茄、小麦和土豆中是成功的碱基编辑器。Target-AID和rAPOBEC基的CBEs分别能脱氨位于原间隔体的2-6 bp和4-8 bp的胞嘧啶。
如果目标胞嘧啶更靠近PAM位点呢?使用hAPOBEC3脱氨酶开发的CBE可以在相对于PAM序列的1-17 bp的拉伸窗口内编辑(宗等人，2018）(参见图3中的CBE-3)。
扩大PAM相容性的植物CBE和ABE
上面提到的所有碱基编辑器都是基于SpCas9镍基的，并取决于与碱基(C/ a)适当距离处的“NGG”PAM的存在。但这是否意味着远离“NGG”PAM的目标C或a不能被编辑?它们可以，但它们需要其他基本编辑器平台。华等。构建了一些植物碱基编辑器，将SpCas9替换为SpCas9和SaCas9的突变版本，识别NGG以外的PAM序列(表1)。
| 类型 | Nickase Cas9 (D10A) | 脱氨酶 | PAM需求 | 参考 |
| CBE | SpCas9 | rAPOBEC1 | NGG | 6 |
| SpCas9 | 救援对象(PmCDA1) | NGG | 5 | |
| SpCas9-VQR | rAPOBEC1 | NGA | 8 | |
| SaCas9-KKH | rAPOBEC1 | NNNRRT | 8 | |
| 安倍 | SpCas9 | 这样* | NGG | 9－12 |
| SpCas9-VQR | 这样* | NGA | 8 | |
| SaCas9 | 这样* | NNGRRT | 9 | |
| SaCas9-KKH | 这样* | NNNRRT | 8 | |
| SpCas9-VRER | 这样* | NGCG | 8 |
植物碱基编辑实验设计要点
- 根据你的目标基地在原空间序列中的位置选择一个基地编辑平台。
- 如果您没有在您的目标基因组位点/位点找到合适的' NGG ' PAM，根据PAM序列从表1中选择一个碱基编辑器变体。
- 避免将' C '放在' G '碱基之后，因为CBE在' GC '序列上下文中效率很低。如果无法避免，请选择目标AID版本。
- 预计在某些基因组位点的碱基编辑效率非常低，甚至为零。有些位点可能由于核小体或其他蛋白质的存在而无法被碱基编辑器访问。
- 你可以在转化/转染后48-72小时内检测到碱基编辑。为了稳定转化，再生植株可能要进行基因分型。如果成功的碱基编辑导致任何限制性内切酶(RE)识别位点的产生或破坏，重新分析结果表明，PCR产物的检测是成功的。尽管用碱基编辑器生成indel的可能性很小，但请记住，indel的生成有时也可能导致RE站点的破坏。
非常感谢我们的客座博主宾夕法尼亚州立大学的Kutubuddin Molla说
Kutubuddin Molla是印度奥里萨邦卡塔克国家水稻研究所的农业生物技术专家。目前库图布丁是美国宾夕法尼亚州立大学富布赖特访问学者。Molla博士对水稻的精确基因组编辑感兴趣，并在PSU的杨宜农实验室使用碱基编辑器和HDR方法进行水稻作物改良。
参考文献
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