最后更新:Marcy Patrick
CRISPR技术被广泛用于基因组编辑，因为它比之前的编辑技术更便宜、更快、更容易。每个月都有越来越多的CRISPR工具发布，使CRISPR成为你下一次实验的一个很好的选择!
在这篇博文中，我们将概述一些CRISPR哺乳动物表达系统，每种系统的典型应用，以及潜在的传递方法。
规划CRISPR实验的一般考虑
与任何实验一样，在计划过程中有许多因素需要考虑。对于CRISPR实验，以下框架可以帮助你开始:
- 确定你想要达到什么样的结果:你想要永久敲除基因还是敲入基因?你想不想激活或抑制基因表达吗?你是想制造单点突变吗?你想不想创建与报告蛋白的融合如GFP ?所有这些结果都可以通过不同的CRISPR成分得到最有效的实现。
- 为您的应用程序选择适当的CRISPR工具:Wildtype Cas9或Cas9 nickase是否适合产生敲除或敲入，或引入突变和标签，而催化死亡的dCas9可以与激活或抑制域一起使用来控制基因表达。基本编辑可以帮助你在gRNA靶点附近进行精确的点突变。
- 选择合适的表达系统和传递方法：您需要稳定的集成还是瞬态表达就足够了？您将编辑哪些单元格类型？你想以DNA的形式传递这些成分，还是mRNA或蛋白质传递更合适？
- 决定你将如何评估结果:你们会使用错配修复法检测插入/缺失吗?或者是PCR后再进行凝胶电泳和/或新一代测序更合适?
如果你已经有了一个最终产品，步骤1和步骤2通常会很简单。同理，对于第4步，这与你的具体目标直接相关。然而，当考虑第三步时，你可能会惊讶于可供选择的选项的数量——你如何在它们之间进行选择?
第一步是确定你需要传递的CRISPR成分。最低限度地，任何应用程序都需要一个或多个sgrna和Cas9。如果你想包含同源定向修复(HDR)模板来创建敲入、点突变或添加标签，您还需要递送供体质粒或单链DNA寡核苷酸，因此您需要确保您的表达系统和递送方法与您的所有组件兼容。
接下来，根据你的模型系统考虑这些CRISPR组件的最佳形式。CRISPR试剂可以通过转染、核感染、病毒转导或注射作为蛋白质、RNA或DNA来传递。最后，一旦你确定了最佳的表达系统，你就可以选择将这些CRISPR成分引入目标细胞的最佳方法。
哺乳动物CRISPR表达系统
每个模式系统都有自己的最佳实践，以有效交付CRISPR组件。如果你是CRISPR或你的模型系统的新手，一个好的第一步是查阅文献，看看是否有人已经发表了一个适用于你的系统的协议。Addgene已经存款人提交协议链接到CRISPR论坛在那里你可以找到关于你选择的系统的信息。下表总结了每个表达式系统所包含的各种组件以及适用的应用程序。
| 表达系统 | 组件的系统 | 应用程序 |
| 哺乳动物表达载体 | 驱动Cas9表达的启动子可以是结构性的，也可以是诱导性的。U6启动子通常用于gRNA。可能含有报告基因(如GFP)以鉴定和富集阳性细胞或选择标记以产生稳定的细胞系。 | Cas9和/或gRNA在哺乳动物细胞系中的瞬时或稳定表达，可以高效转染。 |
| 慢病毒转导 | Cas9和gRNA可以存在于单个慢病毒转移载体中，也可以存在于单独的转移载体中。可能含有报告基因(如GFP)以鉴定和富集阳性细胞。可能包含一个选择标记来产生稳定的细胞系。包装和包膜质粒提供制造慢病毒颗粒的必要成分。 | Cas9和/或gRNA在各种哺乳动物细胞系中稳定、可调的表达。适用于难转染的细胞类型并可使用在活的有机体内．一种常用的指挥方式利用CRISPR进行全基因组筛查． |
| AAV转导 | 只有兼容SaCas9(包装限制~ 4.5 kb)。将CRISPR元素插入到AAV转移载体中，用于生成AAV粒子。 | SaCas9和/或gRNA的瞬时或稳定表达。感染分裂细胞和非分裂细胞。AAV是一种毒性最小的治疗方法在活的有机体内病毒交付。 |
| Cas9 mRNA和gRNA | 含有gRNA和Cas9的质粒用于在体外转录反应生成成熟的Cas9 mRNA和gRNA。RNA通过微注射或电穿孔传送到靶细胞。 | CRISPR成分的瞬时表达，随着RNA在细胞内降解，表达量下降。可以用来产生转基因胚胎。 |
| Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物 | 纯化的Cas9蛋白在体外转录的gRNA结合形成Cas9-gRNA复合物交付利用阳离子脂质转化细胞。 | CRISPR成分瞬时表达，随着gRNA和Cas9蛋白在细胞内降解，表达量下降。 |
哺乳动物细胞系的递送方法
如上所述，你在许多方面选择的表达系统决定了将这些CRISPR成分引入目标细胞的最佳方法。将这些成分递送到哺乳动物细胞系是非常广泛的，包括几种不同的方法，所以我们总结了一些常见的递送方法的关键特征如下:
化学转染
| 脂质介导 | 阳离子聚合物 | 磷酸氢钙 | |
| 细胞 | 转化细胞系 | 转化细胞系 | 转化细胞系 |
| 货物 | 核酸或蛋白质 | 核酸 | 核酸 |
| 吞吐量 | 高 | 高 | 高 |
| 效率 | 媒介 | 媒介 | 媒介 |
| 困难 | 容易 | 容易 | 容易 |
物理转染
| 电穿孔/ Nucleofection | 显微镜下注射 | |
| 细胞 | 许多类型 | 单个细胞 |
| 货物 | 核酸或蛋白质 | 核酸或蛋白质 |
| 吞吐量 | 高 | 非常低的 |
| 效率 | 高 | 非常高的 |
| 困难 | 非常容易 | 非常困难的 |
病毒交付
| 慢病毒 | 逆转录酶病毒 | AAV | |
| 细胞 | 分裂或: | 分 | 分裂或: |
| 货物 | 核酸 | 核酸 | 核酸 |
| 吞吐量 | 低 | 低 | 低 |
| 效率 | 变量 | 变量 | 变量 |
| 困难 | 硬 | 硬 | 硬 |
这些表格不包括所有的方法，这些方法也不限于体外细胞培养。用户应该回顾现有文献关于他们喜欢的模式。
如果你的表达系统在CRISPR使用方面没有很好的特点，你会想要投资一些时间来优化和测试CRISPR传递的效率。Addgene有一些质粒已经作为CRISPR检测工具发表:
交通灯报告系统:可以评估慢病毒成分传递以及基因组修复非同源端连接(NHEJ)或HDR。
sgrna的EGFP验证:通过将基因组靶序列克隆到EGFP报告基因中，可以评估成分传递和sgRNA疗效。
靶DNA报告系统能够使用经过验证的工具评估组件交付。
特别感谢Joel McDade创建了Expression Systems表。Marcy Patrick参与了这篇文章的写作。
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
在Addgene.org上的资源
- 浏览哺乳动物系统CRISPR质粒
- 看看我们CRISPR引导页
- 视图CRISPR协议
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