CRISPR 101: gRNAs的多重表达

最初发表于2016年1月28日，最后更新于2020年9月10日。

CRISPR使定位多个位点变得容易——这一概念被称为多路复用．由于CRISPR是一个如此强大的系统，当你在一个质粒上添加多个grna时，编辑或标记效率通常不会改变。听起来好吗?Addgene有很多工具来帮助你进行多重复制——我们将使用哺乳动物质粒向你介绍一些潜在的选择和克隆方法，但请向下滚动寻找适合其他模型系统的质粒，包括大肠杆菌、植物、果蝇,斑马鱼!

为什么使用多路grna ?

通过在同一个质粒上表达多个gRNAs，可以确保获得质粒的每个细胞都包含所有所需的gRNAs。这将增加您想要进行的所有编辑发生的机会。

多重grna有很多原因，其中一些是:

• 使用双nickase生成敲除或编辑。这有助于减少偏离目标的活动。
• 通过移除两个靶位点之间的序列来删除基因组的一个大区域。
• 同时修改多个基因。使用多重grna可以针对基因组中的多个位置进行修改，无论是编辑CRISPRi、CRISPRa还是碱基编辑。

多路复用grna:基础

Addgene高级科学家收到的一个常见问题是:我可以使用质粒从单个启动子表达多个gRNA吗pX330？不幸的是，简短的答案是否定的。除非你使用一个系统来处理一个连续的多gRNA转录本，否则每个gRNA必须从它自己的启动子表达。但这并不意味着你必须克隆和转染多个启动子- grna结构，以针对多个位点!在这篇文章中，我们将介绍Cas9多路复用选项，但也请查看我们关于Cpf1多路复用的博客文章。

图1:多路复用允许研究人员从一个结构表达多个gRNA。DNA和gRNA不是按比例排列的。

让我们从最简单的多路复用情况开始:您只需要同时表达两个grna。一个你可以使用的系统是pX333文图拉实验室．pX333是pX330的一个修饰，含有人源化的wtCas9和两个U6启动子。要使用这个质粒，你只需为你选择的gRNA目标序列订购寡核苷酸，然后像克隆单个gRNA一样克隆它们。你将用限制性内切酶BbsI克隆第一个gRNA，用限制性内切酶BsaI克隆第二个gRNA。如果你在果蝇，表达双grna的质粒可从布洛克实验室，可以使用Gibson Assembly或SLIC克隆方法插入grna。一个BsaI-based大肠杆菌多路复用质粒可从Koffas实验室．

使用金门和吉布森组装方法扩展多路grna

如果想要增加质粒中grna的数量，就需要使用一些组装方法，如金门组装或吉布森组装。

grna的金门组装

金门装配使用IIS型限制性内切酶，它在识别序列之外裂解，产生侧翼悬垂。这些悬挑可以被定制，以将多个片段链接在一起，允许将多个组件有序组装到目标向量中。

CRISPR/Cas9金门多路技术的第一步是利用BbsI酶将指定每个gRNA靶序列的寡核苷酸克隆到不同的表达载体中。这些表达载体都包含启动子- grna构建侧翼的IIS型限制性位点，但位点附近的序列不同。当用适当的IIS酶消化时，独特的侧翼悬垂序列可以连接在一起，以允许有序组装成表达Cas9的目标载体。下面的示意图说明了这一点。

Gersbach实验室多路复用质粒:

这质粒组可以表达2-4个grna，理想数量是4个。首先，你生成4个独特的卡那霉素耐药质粒，每个质粒都包含7SK、人类U6、小鼠U6或人类H1启动子下游不同的gRNA靶序列。如果你表达少于4个grna，你将在每个未使用的启动子的polyt终止序列中克隆。这一步对于生成最后的结扎步骤所需的所有悬垂是必要的。质粒随后用BsmBI酶切并连接到含有Cas9或dcas9的目的载体上。目标矢量选项包括人性化的wt Cas9，dCas9(转录抑制因子),dCas9-VP64(转录激活)含有质粒。每个目的载体都含有GFP，可以选择高GFP表达的细胞。这些细胞具有最高水平的Cas9和gRNA表达，因此基因组编辑事件的频率也最高。

Yamamoto Lab Multiplex CRISPR/Cas9 Assembly Kit:

这个工具包是为严重的多路复用而构建的，使用户能够表达多达7个grna。该试剂盒包含不同的目的载体，取决于你希望克隆的grna的总数，从2-7个。例如，如果你要表达4个grna，你会使用pX330A-1x4；对于6个grna，你会使用pX330A-1x6．这种自定义意味着你永远不需要克隆填充序列。为了构建你的多路复用结构，你将除了一个以外的所有grna克隆到大观霉素抗性质粒中pX330S-2 to pX330S-(最后一个gRNA编号)．将5 ' most gRNA克隆到含cas9的目的载体中。这些结构体被BsaI酶切并组装成一个编码gRNAs和Cas9的质粒。和格斯巴赫实验室的质粒一样，多种Cas9变种可用: wt人性化Cas9, D10Anickase突变(Cas9n)、dCas9(转录抑制)Fok1-dCas9(二聚的核酸酶)。

网关组装方法

Frew Lab Multiple Lentiviral Expression Systems (MuLE)试剂盒:

该试剂盒可用于创建表达wt人源化Cas9和多达3种grna的慢病毒载体。188完整比分直播该试剂盒提供含有U6启动子和gRNA支架的进入载体。指定gRNA种子序列的寡核苷酸应与IIS型酶BfuAI兼容。网关克隆然后将多个gRNAs和Cas9结合成一个单独的质粒。虽然该试剂盒只提供wt hCas9进入载体，但您可以克隆包含其他Cas9变体的自己的进入载体，以使用MuLE系统。

从一个单一的副本多路转换

也可以通过多顺反子转录本使gRNAs多化。不是从不同的启动子转录，而是一起转录，两侧有特定的位点，允许它们被切割和释放。这些结构体往往比具有多个启动子- grna盒的结构体更小，这使得它们对于像AAV这样容量较小的载体具有优势。除了下面描述的哺乳动物选择，用于制造多顺反子gRNAs的质粒也可从杨实验室在植物中使用。

哺乳动物的多重系统使用来自Csy4 RNA核酸酶铜绿假单胞菌．当过表达时，Csy4能有效地切割夹在28个Csy4碱基识别位点之间的gRNAs。如果没有Csy4，则无法释放grna，增加了对系统的时间和/或空间控制。pSQT1313从Joung实验室允许表达两个用寡核苷酸组装而成的grna。不像上面描述的一些质粒，这个载体不包含Cas9，所以你需要用另一个质粒来提供它。

图3:Multiplex策略的比较，包括标准PolIII-gRNA盒，csy4可拆盒，PTG盒。

在Addgene找到gRNA复用载体!

植物中多路复用

Chen Qi-Jun Lab Golden Gate/Gibson Assembly Multiplexing plasmid:

这些质粒允许你通过金门或吉布森组装2-4个grna。利用BsaI将grna插入pCBC载体，通过PCR扩增启动子- grna片段，克隆成其中一个Zeamays密码子优化的cas9二进制载体。该系统适用于单子叶植物和双子叶植物。

金门/吉布森组装多路复用质粒:

这些质粒可以通过金门或吉布森组装表达多达8个gRNAs。利用BsaI，将gRNAs克隆到12个pYLsGRNA质粒中的一个，这些质粒包含各种启动子和报告子，然后插入到一个基于pCAMBIA的含有cas9的目的载体中。Cas9是植物优化的，质粒可用于单子叶和双子叶植物，可以选择湿霉素或Basta选择。

Yang实验室单转录多工质粒:

这些质粒与上面描述的Csy4多顺反子系统相似，除了它们使用内源性核酸酶系统来切割gRNAs。甘氨酸trna (glycine tRNA-gRNA, PTG)是甘氨酸trna的侧面组成的多顺反子甘氨酸tRNA-gRNA (glycine tRNA-gRNA, PTG)结构体。真核rna酶P和Z识别tRNA序列，切割它们，释放grna。通过金门组装将PTGs组装成一个wt cas9载体，最多可以同时表达8个grna。瞬时表达和农杆菌介导转化的载体都是可用的。有关此系统的更多信息，请查看这篇博客．

多路复用在斑马鱼

陈文彪实验室金门组装多重质粒:

这些质粒允许斑马鱼表达2-5个gRNAs。自定义目标载体的使用取决于您希望克隆的grna的总数，因此您不必克隆任何填充序列。你还可以选择加入先前设计的tyr gRNA，它会导致色素降低，从而标记出经过基因组修饰的细胞。在这种系统中，Cas9必须在单独的质粒上提供。

多路复用的果蝇

布洛克实验室多重质粒:

可以使用Gibson Assembly或SLIC克隆组装两个grna。两个果蝇U6启动子表达了gRNAs。Cas9必须放在单独的质粒上。

多路复用的大肠杆菌

Koffas实验室CRISPathBrick多重质粒:

这个系统允许你为基于dcas9的转录抑制组装II-A CRISPR阵列。CRISPathBrick质粒包含一个非靶向间隔体，其两侧有两个CRISPR重复序列。可以使用BsaI对间隔项进行分解，从而允许插入间隔重复“块”。BsaI站点保持完整，允许后续的“砖块”一个接一个地添加。这种方法对组合分析特别有用。例如，如果您要开发一个使用3个不同的间隔重复序列的数组，那么您可以轻松地创建7个惟一的数组(例如，对于间隔符A、B和C，您可以获得数组A、B、C、AB、AC、BC和ABC)。

尼尔森实验室大肠杆菌CRMAGE质粒:

CRMAGE系统是将CRISPR和基于重组的MAGE (Multiplex Automated Genome Engineering)技术结合起来的一种快速、多路复用的方法。pMA7CR_2.0表达lambda Red和Cas9，分别由l -阿拉伯糖和无氢四环素(aTet)诱导。pMAZ-SK包含一个aTet诱导的gRNA和一个骨干靶向gRNA盒，用于l -鼠李糖和aTet诱导后通过“自我破坏”的质粒固化。CRMAGE比传统的重组效率高得多，点突变的效率为96-99%，小插入的效率为66%。同时对两个目标进行多路复用是可能的，效率为70%。CRMAGE是一种非常快的协议，单轮编辑只需要5小时的孵育时间，后续的治疗协议只需要2-3小时的孵育时间。

近藤实验室多路基地编辑E．杆菌

Kondo实验室表达了Cas9与带有降解标签(LVA标签)的尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的胞苷脱氨酶融合，以实现特定的点突变E．杆菌．grna被传送到不同的质粒上，并允许同时对6个不同的基因进行多重编辑。这个系统不依赖于任何额外的或宿主依赖的因素，可以用于广泛的细菌。

参考文献

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