CRISPR 101：非同源末端连接

最后更新2020年9月1日。

本文由北卡罗来纳大学教堂山分校的大卫·怀亚特和戴尔·拉姆斯登贡献。

将CRISPR/Cas系统用于基因组工程的一个优点是，Cas9可以很容易地编程，在用户选择的任何位置在基因组中产生DNA双链断裂（DSB）。初始切割后，该过程中的下一步包括修复染色体双链断裂．重要的是要知道，细胞有两种主要的修复途径- - - - - -非同源端连接(NHEJ)和同源定向修复（HDR）以及这些途径是如何工作的，因为这可能与你的实验计划有关。在这里，我们将讨论NHEJ，以及它如何影响基因组中cas9介导的dsb发生。

非同源末端连接步骤

与HDR不同，NHEJ在整个细胞周期中都是活跃的，具有更高的修复能力，因为它不需要修复模板(姐妹染色单体或同源物)或广泛的DNA合成。NHEJ也完成修复大多数类型的中断在几十分钟- - - - - -比HDR快一个数量级。因此，NHEJ是CRISPR/ cas9引入的断裂被修复的主要手段。

无论末端结构如何，NHEJ修复都需要以下因素，并决定该通路的主要事件:

1. 断端可通过加载电缆来识别Ku70/Ku80异质二聚体
2. 然后Ku作为激酶募集的支架(DNA-PKcs)和两个亚基DNA连接酶（XRCC4连接酶IV）；加上一些辅助因素(PAXX，XLF)，这个复合物将一对DNA末端连接在一起，形成一对末端复合物
3. 配对末端复合物然后将兼容的DNA末端连接在一起，从而修复断裂。

这是该途径的简化、流线型版本，并且不考虑DSBS生物源常见的缺失或损坏的核苷酸，并且需要进行处理。处理发生在连接之前，因为不相容的DNA末端干扰了该步骤。因此，NHEJ拥有大量的加工因子工具箱，包括聚合酶（Polμ和Polλ）、核酸酶（Artemis）和结构特异性末端清洁酶（Aprataxin，Tdp2），其功能是使末端成为更好的连接底物。虽然我们这里不描述这些步骤，但DNA末端的处理往往是引入突变的点。

NHEJ修复Cas9引起的断裂

如下所示，nhej介导的cas9产生的断裂修复是有用的，如果目的是敲除你感兴趣的基因，因为它容易产生indel错误。NHEJ修复过程中产生的Indel误差通常很小(1-10 bp)，但异质性极大。因此，大约有三分之二的机会引起帧移突变。一些重要的是，当受到侧翼序列同源性(“微同源性”)的限制时，缺失可以减少异质性。

NHEJ不会强制引入INDEL。鉴于Cas9 DSB的末端结构（钝端或近钝端，无核苷酸损伤），此类产物很少见，可能占修复事件的不到5%。然而，精确修复的产品很容易被重新切割，而indel产品则不会，因此重复的循环将有利于后一种产品的积累。如上所述，单次切割和精确修复周期应不到一小时，因此组成性表达靶向Cas9的细胞群体应在一天内在其大多数染色体上具有INDEL。另一个预计会影响修复的因素是Cas9蛋白在裂解后不会立即从断裂端释放，这可能会干扰Ku的负载和正常NHEJ活性。其他因素也会影响NHEJ活动。例如抑制RecA和过度表达NHEJ机制提高了NHEJ的精度米．鼻窦炎(Yan et al.， 2020)。

NHEJ也可以通过规范Cas9方法的变体参与。如果NHEJ将远端连接在一起，则位于数百个或更多碱基对两侧区域的一对CRISPR导管可同时引入一对染色体断裂，并可能导致中间DNA的缺失（“弹出”缺失）。类似地，通过NHEJ依赖性修复（“pop-in”插入）将外源DNA片段直接插入Cas9靶向断裂（或一对断裂），前提是包含兼容悬挑的模板可用. Cas9也可以改变以产生目标单链断裂；当两个这样的断裂以相反的股线彼此靠近引入时。这种“双尼克斯”策略大大减少了非靶点的突变和突变。

克里斯蒂娜·莫克对这篇文章的更新做出了贡献。

感谢我们的客座博客！

大卫·怀亚特(David Wyatt)是一名研究生，他对确定断端结构如何影响其修复感兴趣。他在戴尔的实验室工作。

戴尔·拉姆斯登是北卡罗莱纳大学教堂山分校遗传和分子生物学、生物化学和生物物理系以及Lineberger综合癌症中心的课程成员。

工具书类

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