CRISPR 101: Cas13a (C2c2)靶向RNA

本文于2020年7月27日更新。

CRISPR，特别是来自链球菌SpCas9是一种非常出色的基因组工程工具。它易于使用，在大多数物种中具有功能，并有许多应用．也就是说，SpCas9并不是唯一的游戏，而且其他Cas蛋白质就像SaCas9和Cpf1可以绕过SpCas9相关的限制吗．Cas13a(以前称为C2c2)有几个独特的属性，可以进一步扩展CRISPR工具箱。我们将介绍Cas13a是如何被识别的，Cas13a的结构和功能，重点是这个分子的独特之处，以及Cas13a的各种应用。

Cas13a的起源:RNA裂解CRISPR核酸酶

Cas13a是最初于2015年确定(Shmakov等人，2015)。他们使用Cas1该基因通常与CRISPR阵列相关，并参与感染后的间隔体获取，作为一种“诱饵”，以识别细菌基因组中新的CRISPR相关蛋白。通过分析，他们确定了53个潜在的候选基因，根据CRISPR蛋白的结构分为3类:C2c1, C2c2和C2c3 (Class 2, candidate 1, 2, or 3的缩写)。C2c1和C2c3与CRISPR蛋白相关Cpf1，但它们需要tracrRNA和crRNA来切割目标DNA (Cpf1只需要crRNA来识别目标和切割)。C2c2(现在被称为Cas13a)在结构和功能上是独一无二的，因此将是这篇博文剩下部分的重点。

也许Cas13a和Cas9之间最大的区别在于Cas13a结合并切割RNA而不是DNA底物。在结构上，Cas13a与最常用的CRISPR酶没有同源性——Cas13a包含两个hehn结构域，而Cas9使用HNH和RuvC结构域来切割靶DNA。Cas13a内的HEPN结构域对RNA切割至关重要，这与其他蛋白中已知的HEPN结构域的作用一致。与Cas9一样，Cas13a分子中关键残基的突变会导致一个“核酸酶死亡”Cas13a (dCas13a)，它能够结合靶RNA，但缺乏切割靶RNA的能力。

表1:常用CRISPR酶的比较

Cas13a靶向单个crRNA

的冯张实验室使用Cas13a从纤毛菌属shahii(LshCas13a)开始描述这种新的效应(Abudayyeh等人，2016)。在内源性CRISPR/Cas9系统中，Cas9使用tracrRNA和crRNA分别促进靶DNA的结合和切割。而LshCas13a仅使用一个短的~24碱基crRNA，通过富含尿嘧啶的茎环与Cas13a分子相互作用，并通过Cas13a分子的一系列构象变化促进靶标结合和裂解。与Cas9一样，Cas13a也能容忍crRNA与靶序列之间的单次错配，但当存在2次错配时，Cas13a的切割效率会降低。LshCas13a的原间隔体侧翼序列(PFS)与LshCas13a的原间隔体侧翼序列相似PAM序列对于Cas9，位于间隔序列的3 '端，由单个a、U或C碱基对组成。

在细菌中，Cas13a一旦识别并切割crRNA序列所指定的目标RNA序列，就会进入酶的“活性”状态，而不是像Cas9或Cpf1那样恢复到非活性状态。因此，不管与crRNA是否同源或有无PFS, Cas13a都会结合并切割额外的rna。这与Cas9形成鲜明对比，Cas9要求每个DNA靶点对间隔序列具有较高的序列同源性，并包含适当的PAM序列。非特异性切割被认为是激活被噬菌体感染的细菌细胞的程序性死亡或休眠状态，以限制感染在整个人群中的传播。Cas13a的这一特性为将Cas13a用作诊断工具提供了可能性，如下所述。

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应用Cas13a

图1:使用Cas13a作为诊断工具。包含感兴趣序列(红色)的DNA或RNA核苷酸库分别使用重组酶聚合酶扩增(RPA)或逆转录RPA (RT-RPA)进行扩增。扩增核苷酸与Cas 13a结合，crRNA靶向序列和灭活荧光RNA报告。如果目标序列存在于核苷酸池中，Cas13a的非特异性RNAse活性将被激活，RNA报告基因将被剪切，导致荧光团的激活。荧光信号可以作为一种指示剂来确定目标序列是否存在于原始核苷酸库中。

根据我们对其结构和功能的了解，Cas13a的潜在应用是什么?首先，Cas13a可以用于结合和切割靶RNA，尽管它在细菌细胞中的用途可能会受到Cas13a非特异性结合和切割RNA的倾向的限制。dCas13a结合目标RNA而不切割分子(如dCas9)的能力表明，dCas13a可能有助于从群体中分离特定的RNA序列(从RNA库中富集或耗尽特定RNA)或研究活细胞中的RNA处理。事实上，研究小组已经利用dCas13融合蛋白来成像、跟踪、调节剪接和调节特异性靶向rna的表达。

最后(也许是最有趣的)，Cas13a在结合用户定义的RNA序列后，能够切割任何RNA的倾向可能是用于检测具有高度特异性的RNA物种的单个分子(Gootenberg等人，2017)。这个系统,被称为《神探夏洛克》(如图1所示)已被用于区分寨卡病毒的毒株、人类DNA的基因型、识别无细胞基因组DNA中的肿瘤突变以及检测COVID-19(jung, Ladha等人，2020年)。

哺乳动物细胞中的Cas13a

张的实验室有了令人兴奋的发现Cas13a同源基因可在哺乳动物和植物细胞中发挥作用(Abudayyeh等人，2017)。他们用一种超级折叠GFP融合技术来稳定哺乳动物细胞中的Cas13a，对来自瓦代纤毛菌(LwaCas13a)的Cas13a进行了表征。LwaCas13a-msfGFP可以介导长度为20-28个核苷酸的间隔物的切割，不需要特定的PFS，使其成为一个非常灵活的切割系统。LwaCas13a也可以复用;同时表达5个gRNA会产生与单个gRNA表达相当的基因敲除。

虽然副RNA切割反应在细菌细胞中有很好的描述，LwaCas13a在真核细胞中不显示非特异性RNA切割活性．他们通过分析整体RNA表达、细胞应激和RNA大小分布得出了这一结论。当比较LwaCas13a和shRNA时，他们发现LwaCas13a表现出类似的敲除效率，但没有显著的脱靶效应，这与数百个观察到的shRNA脱靶形成鲜明对比。他们随后使用催化非活性的dLwaCas13a作为可编程RNA结合蛋白，创建荧光融合蛋白dLwaCas13a- nf用于体内RNA成像。

简而言之，Cas13a分子为CRISPR工具箱带来了一个备受期待的多样性元素，并将继续扩大CRISPR的应用。自从这篇文章最初发表以来，我们也看到了Cas13b作为工具的新发展RNA编辑基础我们很高兴看到这组酶继续在CRISPR领域引起轰动。我们认为，CRISPR领域的共享文化是该领域快速技术发展的重要组成部分。一如既往，我们感谢有机会与科学界分享这些宝贵的试剂。

注:Cary Valley和Mary Gearing对这篇文章的更新做出了贡献。

参考文献

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• 从这篇论文中找到质粒在Addgene．

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7.jyoung J, Ladha A等，“使用SHERLOCK诊断工具进行COVID-19即时检测”。medRxiv2020年5月8日。PubmedPMID: 32511521．公共医学中心PMCID: PMC7273289．

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