CRISPR 101:验证你的基因组编辑

Michael Lemieux于2020年10月9日更新。

你已经创建了gRNA表达结构，并使用Cas9将其引入目标细胞。万岁!你可以开始读取数据了，对吧?几乎。在这篇博文中，我们将解释如何验证你的单元格是否被适当编辑过。我们还将介绍检测插入、删除和突变事件的基本技术。

过程概述

验证基因组编辑的方法因物种和编辑类型而异。在这篇文章中，我们将关注二倍体哺乳动物细胞，但许多原则将适用于不同的模式生物。

将Cas9和gRNA（可能与供体模板一起）引入细胞将导致细胞混合。在哺乳动物细胞中引入Cas9介导的双链断裂（DSB）后，细胞机械通过以下方式修复DSB：非同源末端连接（NHEJ）或同源性定向修复(HDR)。在哺乳动物细胞中，通过NHEJ途径修复主要导致indel错误的产生在里面sertions和德尔核酸序列，在DSB位点。除了在cas9诱导的dsb中引入的indels的异质性，等位基因的编辑频率也会发生变化。HDR通路需要一个修复模板的存在，该模板用于以更具体的方式固定DSB。HDR将修复模板的序列忠实地复制到被切割的目标序列中。有些细胞不会被编辑，有些只有一个等位基因被编辑，有些两个等位基因都被编辑。

验证过程的第一步是快速评估是否编辑了大量单元格（见图1）。对于INDEL，使用错配裂解分析可观察到这一点（见图2）。对于HDR，这通常通过在感兴趣的位置上的限制模式的变化或通过报告器读数来可视化。对于删除（见图3），这可以通过位于要删除区域两侧的引物产生的PCR产物的大小减小来观察。

一旦你知道你的一部分细胞已经被编辑，你可以继续创造克隆细胞系。连续稀释可用于分离单细胞，然后延长一段时间以产生这些细胞系。如果你的质粒上有荧光蛋白标记，你可以用流式细胞术来丰富接受Cas9和gRNA的细胞。扩增后，检测每个细胞系并对感兴趣的区域进行测序，以验证如图1所示的基因组编辑。但不要止步于此，因为您可以在四个不同的水平(DNA、RNA、蛋白质和表型)验证您的编辑。根据编辑的性质，可以使用类似qRT-PCR的方法来显示mRNA转录水平的差异。western blot可以评估蛋白质表达，表型分析对于证明编辑的功能结果至关重要。在这篇文章中，我们将主要关注DNA水平的验证，所以继续读下去了解更多!

错配切割法检测吲哚

错配切割试验是一种快速简便的检测INDEL的方法。测量员商标核酸酶通常用于这一目的，因为它能将两股DNA裂解成任何不匹配的DNA链。它可以检测多达12个核苷酸，对频率低至32个拷贝中有1个的突变非常敏感。

错配切割分析通常包括四个步骤：1）PCR扩增感兴趣的区域，2）变性链并重新杂交以允许突变链和野生型链退火，3）用PCR处理退火的DNA商标4)在琼脂糖凝胶或其他根据大小分离DNA的仪器上分析DNA。图2说明了该分析是如何工作的。在这个例子中，两个+gRNA通道都包含了预期大小的剪切片段，这表明gRNA成功地在目标区域产生了插入物。这种分析通常是半定量的，在这种情况下，gRNA1似乎比gRNA2更有效地产生吲哚。这是因为gRNA1的低分子量带在凝胶上强度更大，这表明它产生了更多的可被Surveyor识别和剪切的indele商标核酸酶。

如果您更愿意选择错配裂解分析作为半定量检测INDEL的方法，您也可以尝试RFLP分析。RFLP代表限制性片段长度多态性，可以在INDEL创建或取消限制性内切酶识别位点时使用。在对目标区域进行PCR扩增并随后用适当的酶进行消化后，可以在琼脂糖凝胶或其他根据大小分离DNA的仪器上运行DNA，并分析限制性模式以确定多克隆细胞群中indel形成的程度。RFLP分析比错配切割分析具有优势，因为它可以检测纯合突变。主要的缺点是，您必须有一个修改过的限制识别站点才能使这种方法起作用。

检测同源定向修复

如果您想使用HDR突变您的感兴趣区域，建议首先通过创建INDEL和进行错配切割分析来确定您的gRNA是否有效切割了您的目标序列。一旦您选择了最佳gRNA，请将其与Cas9和您的修复模板一起引入，以驱动HDR。

在设计HDR提供程序模板时，要提前计划集成事件的检测。例如,你可以有目的地引入或去除限制位点，这将改变PCR产物的消化模式。或者，您可以包含一个报告元素，用于在DNA、RNA或蛋白质水平上检测HDR。通过PCR产物的大小变化也可以检测到整合后的大的插入或缺失。如果多态性创建/移除限制性摘要位点，单核苷酸变化可以使用限制性摘要快速分析。此外，可以通过TA克隆和Sanger测序、下一代测序或液滴数字PCR基因分型检测单核苷酸变化。

请记住，执行连续稀释和生成克隆细胞系将有助于验证您的基因组编辑。这是因为CRISPR-Cas9系统对群体中的不同细胞进行不同的编辑，这会使结果的解释变得复杂。例如，如果你从一个混合群体中测序，你会在Sanger测序色谱图中看到许多重叠的峰。Sanger Amplicaton测序可以让您大致了解到发生了一些编辑，但您不知道哪些细胞被成功修改。

HDR事件的频率通常比indels低，因此您可能需要筛选更多的菌落来创建克隆系。需要筛选的克隆数量取决于转染/转导效率和HDR频率。例如，如果你有40%的转染效率和5%的HDR效率，大约0.4x0.05=0.02或2%的细胞将具有重组区域。因此，您应该计划筛选至少50个菌落。如果您能够选择使用标记物成功转染/转导的细胞，那么您可以测试更少的菌落。

查看我们关于CRISPR基因分型的测序选项的帖子

PCR检测缺失

大多数缺失是通过使用两个引导Cas9切割DNA中间区域的GRNA产生的。因此，可以通过使用缺失区域两侧的引物进行PCR来检测缺失。该工作流与图1中描述的工作流类似。图3提供了一个PCR结果的例子，该结果是通过筛选一组克隆系进行删除而获得的。在本例中，克隆1、5和7对于删除是杂合的，克隆4对于删除是纯合的。

查看我们关于使用数字PCR验证基因组编辑的博客文章

下一代测序以验证编辑并检测偏离目标的效果

如果您的实验室有资源，您可以使用下一代测序（NGS）对目标序列和基因组其他区域中的基因组编辑进行定量评估。如果您有大量样本和/或希望同时查看偏离目标的更改，则NGS是一个不错的选择。使用此方法时，重要的是要有一套控制细胞作为您需要将编辑样本的测序读数与未处理的群体进行比较。软件，如脆咖啡可以帮助进行数据分析。

但是如果你的实验室没有NGS的资源呢？您仍然可以选择检测偏离目标的效果。你可以使用Sanger测序，前提是你对基因组中可能发生的非目标编辑有一些概念。使用生物信息学预测分析如CRISPRitz或CRISPOR可以帮助缩小可能发生偏离目标编辑的站点列表，允许您对概率更高的站点进行可管理的排序。

如果您担心脱靶效果，还可以考虑使用专门为减少脱靶编辑而设计的Cas9版本，如SpCas9-HF1、eSpCas9(1.1)或HypaCas9。

这篇文章中描述的技术不是CRISPR特异性的，也可以用于评估由CRISPR创建的基因组编辑取得或锌指核酸酶. 无论使用何种方法，验证编辑都是在为将来的实验做准备时花费的时间。

感谢David Scott(张峰博士的实验室)，Joel McDade (Addgene)和Marcy Patrick (Addgene)提供的有用的评论和编辑。

参考文献

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