正如肯德尔在周二的博客文章中提到的，跟上最新的CRISPR技术及其应用可能会让人精疲力尽。在Pubmed上快速搜索“CRISPR”(Clustered regular Interspaced Short Palindromic Repeats的简写)，返回728篇文章(3/12/2014)。CRISPR质粒工具的选择如此之多，需要做出的实验设计决策也如此之多，所以科学家们(其中许多人是第一次尝试基因组编辑)有很多疑问是有道理的。
为了跟上这些问题，乐聪博士和张峰博士开发了谷歌论坛，让科学家们可以在飞行中提出问题并得到答案。但就像PubMed上不断增长的文章列表一样利用CRISPR/Cas系统的基因组工程已经发展到无法控制的地步为了进一步巩固这些常见问题，Le Cong与Addgene高级科学家Matt Ferenc合作，组织了CRISPR论坛最受欢迎的问题和答案。
以下是CRISPR-Cas9的四个常见问题。如果你在读完这些之后还有问题，我们有还有12个关于基因组编辑的问答使用Zhang实验室的CRISPR/Cas质粒。
设计你的CRISPR基因组编辑实验
我应该在CRISPR基因组工程实验中使用野生型还是双nickase ?
A1:当评估在你的CRISPR基因组工程实验中使用哪种nickase类型时，考虑带有优化嵌合gRNA的野生型Cas9具有高效率，但已被证明具有脱靶效应。“双镍酶”是由Zhang实验室开发的一种新系统，它具有与优化嵌合设计相当的效率，但具有更好的准确性(换句话说，更低的脱靶效应。
双镍酶系统是基于Cas9 D10A镍酶的图4Cong等人，2013年的科学论文。例如，如果你想使用双nickase，你可以表达两个间隔符并使用PX335表达Cas9n (nickase)。
双镍酶系统的概念是，你可以用Cas9镍酶表达两种不同的嵌合gRNA，它们将共同引入目标位点的裂解，效率类似于使用单一嵌合gRNA。与此同时，脱靶效应降低了，因为Cas9 nickase不像野生型Cas9那样具有诱导双链断裂的能力。有一些关于双镍酶系统的参考文献，包括最近有一位来自张氏集团．
了解更多在这里．
Q2:当设计寡聚体将我的目标序列克隆到使用人类U6启动子驱动表达的主干时，是否有必要在我的目标序列的开头添加一个G核苷酸?
A2:人类U6子喜欢‘G’转录开始网站有很高的表达,所以添加这个G可以帮助表达,虽然仍然是质粒的表达未经G G .因为只有一个基地,张实验室时通常将其添加益生元。如果你的间隔序列以“G”开始，你自然就有一个，不需要添加额外的“G”。
Q3:使用CRISPR/Cas进行同源重组(HR)可以插入基因组的DNA的最大数量是多少?为了有效的重组，同源臂应该有多长?
A3:到目前为止，我们尝试插入的最多的是1kb。我们使用了800bp长的同源臂。
在实验室使用CRISPR-Cas9的提示
Q4:在基因组引入突变后，如何选择/筛选具有突变的细胞?
A4:在开始你的实验之前，考虑与GFP共转染。这允许你对gfp阳性细胞进行分类，并对那些正转染的细胞进行富集。或者，您可以使用选择标记来选择转染细胞(例如，带有嘌呤霉素耐药盒的质粒，例如PX459）.用同源重组(HR)模板共转染CRISPR/Cas系统后，可以:
- 通过限制性片段长度多态性(RFLP)确认您的HR (见图4Cong等人，2013年的科学论文)。
- 如果你检测到阳性的HR，分离单细胞菌落，培养它们，然后对每个菌落进行单独的基因分型(例如使用Sanger测序)，以筛选阳性的。
——或
- 如果您的HR模板有选择标记，如嘌呤霉素，您(也)可以通过嘌呤霉素选择阳性菌落。然后，您可以通过执行基因分型分析(如Sanger测序)来确认这种纯化。
更多常见问题、CRISPR协议和gRNA设计工具
需要回答更多关于CRISPRs的问题吗?
- 检查乐从回答了16个常见问题
- 读Addgene的CRISPR背景信息指南CRISPR / Cas9系统
- 阅读最新的基因组编辑评论文章，如:Sander JD & jung JK，自然生物技术，2014年3月2日。
- 或浏览与最常见的CRISPR相关的文章质粒在Addgene
查找协议和gRNA设计工具:
- CRISPR协议列表由多个实验室开发，并针对特定的质粒进行优化
- 不同的链接软件来帮助你识别gRNA目标序列
此外，我还要感谢Le Cong的辛勤工作，他为科学界创造了令人惊叹的资源，并与Addgene分享了这些资源。谢谢你,勒!
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