我和布鲁基尼代表Addgene参加了Keystone最近的会议用可编程核酸酶进行精确基因组编辑.查看#ksganome.如果你错过了我们的实时更新!
我从会议中最受欢迎的推文如上所示。我提到的博客文章,约翰博士如何为CRISPR基因组编辑设计您的GRNA,每月的浏览量超过4000次。在我看来,这些数字表明,对于使用CRISPR的研究人员来说,gRNA设计的这个基本概念仍然具有挑战性,标准化和改进各种应用的gRNA设计过程和规则是有必要的。
CRISPR方法的标准化是这次会议的一个共同议题。新体细胞基因组编辑程序,穿过国家卫生研究院共同基金他强调,我们需要更多标准化的方法来评估CRISPR技术,包括日益重要的达标/脱靶效率。同样,NIST基因组编辑联盟希望对基因组编辑流程进行评估,并为基因组编辑研究生成一个通用词汇。这些互补的目标旨在改善CRISPR技术的翻译,但它们也会给进行基础或早期临床前研究的研究人员带来好处。然而,标准的术语和技术还不足以推动CRISPR领域的发展。要做到这一点,我们需要更多地了解细胞DNA修复途径。
强调Cris-Crisprpr裂解后细胞修复
当我第一次看到会议的议程时,我惊讶地发现,它不是以介绍CRISPR核酸酶开始,而是以一个关于DNA修复的会议。那次会面让我印象最深的是埃里克·亨德里克森(Eric Hendrickson)的话,下面的推文大致解释了这句话。
复杂性和挑战同源修复(HDR)在基础编辑器的兴趣中回应,其改变基因组DNA而不需要细胞HDR。
已经有时间消化我的笔记,自会议以来,我认为我可能终于掌握了复杂的DNA修复途径。我完全承认成为DNA修复Newbie - 切除和Strand入侵的图象就像我的外语。但是来#ksgenome并看到DNA修复的复杂性强调这些研究如何提高基因组编辑效率。使用CLSPR,而不是仅设计包含所需编辑的修复模板,我想确保我(和addgene)将来不要忘记这一点。
这里有一份博客文章列表,可以帮助你解决DNA修复的挑战(还有额外的gRNA设计资源)。订阅CRISPR更新在我们的博客上,以最新和最伟大的方式保持当前!
addgene资源
来自客座博主Dominik Paquet和Dylan Kwart的修复模板设计的动手技巧,包括如何切割-变异距离影响编辑效率的详细介绍。
Chris Richardson和Jacob Corn的实验室的成员描述了如何更好地理解Cas9 Biophysics可以帮助加强HDR。
RNP交付方法始终能够在多个系统中实现高的目标编辑率和低的偏离目标编辑率。阅读我们的介绍性博客文章,然后看看这个关于协议的RNP协议.IO.
您的编辑越接近PAM网站,HDR修复的效率越高。查看此帖子以查看工程型Cas9 Variant是否适用于您的实验。
michohomy介导的末端连接(MMEJ),也被称为替代非同源末端连接(Alt-NHEJ),已被用于CRISPR敲入应用。
也许你想要避免编辑基因组而只专注于RNA?Cas13也许能帮到你!
其他资源和出版物
在Keystone会议上,研究人员对CRISPOR有很好的看法,CRISPOR是一个帮助你设计、选择和关闭Cas9和Cpf1指南的工具。这个工具支持超过250个基因组,他们刚刚发布了一个全新的CRISPOR手册开始2018年!
"利用寡核苷酸供体进行基因组精确编辑的机制".Kan, Yinan, Brian Ruis, Taylor Takasugi和Eric A. Hendrickson。基因组Res27(7)(2017):1099-1111。PubMedPMID: 28356322公共医学中心PMCID: PMC5495063
Kan等人使用GFP-BFP转换系统来评估使用ssDNA修复模板的精确基因组编辑模式。他们的工作表明,不同的修复模板策略激活不同的HDR子途径,如合成依赖链退火(SDSA)和单链DNA掺入(ssDI)。
"EASI-CRISPR用于使用LONG SSDNA捐赠者创建敲入和有条件的淘汰鼠标模型".三浦,Hiromi, Rolen M. Quadros, chanabasavaiah B. Gurumurthy和Masato Ohtsuka。NAT PROTOC。13(1)(2018): 195 - 215。PubMedPMID: 29266098
利用CRISPR创建敲入小鼠模型一直是一个挑战,使用dsDNA模板的协议达到了约1-10%的效率。Easi-CRISPR使用一个长ssDNA模板来提高插入和基因替换的效率。
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主题:CRISPR
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