利用CRISPR进行人类种系编辑

注:本博客发表后，一个bioRxiv预印本这对同源物间重组的结论提出了质疑。本博客尚未更新以回应本文。

任何提示的CRISPR编辑人类胚胎遭遇了媒体报道的风暴。但8月2日发表在《自然》杂志上的这篇论文给了我们更多的讨论，因为它代表了对致病突变进行CRISPR种系编辑的又一步。但我们到底有多接近，这篇论文又提出了什么新问题?我们将筛选论文，以了解舒赫拉特·米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)和他的同事取得了什么成就，以及该领域将如何从这项工作向前发展。

实验与主要发现

让我们从论文本身开始:马等。对纠正常染色体显性突变感兴趣MYBPC3这会导致肥厚性心肌病。一个成年男性杂合子4 bp缺失MYBPC3捐赠的皮肤，血液和精液样本。Ma等人设计了含有Cas9和两种不同的质粒gRNAs，并将其与取自患者的诱导多能干细胞中的ssODN修复模板电穿孔。对于第一个gRNA，他们注意到编辑效率很低，总靶向效率只有27.9%homology-directed修复(HDR)发生在41.2%的被编辑细胞中。第二种gRNA的结果更低:13.1%的靶向效率，只有13%的被编辑细胞使用HDR。

Ma等人利用gRNA 1进行了受精后18小时S期受精卵的微注射实验。他们观察到比ips细胞更高的靶向效率，但有镶嵌现象的警告。为了避免这个问题，他们将CRISPR机制与精子共同注入M期卵母细胞，从而在DNA复制之前进行修复。事实上，他们观察到41/42的胚胎在受精后3天没有嵌合。

由于Ma等人设计了一个带有两个同义突变的修复模板，以将其与野生型等位基因区分开来，所以他们能够区分来自模板的修复和来自母体的修复MYBPC3等位基因。有趣的是，他们发现胚胎进行修复不是来自Ma等人提供的单链寡核苷酸(ssODN)模板，而是来自母亲的野生型等位基因(图1)。72.4%的胚胎携带两个野生型副本MYBPC327.6%的胚胎在突变位点携带吲哚，表明修复是通过NHEJ而不是HDR进行的。

在后来的特性研究中，经过编辑的胚胎以与未经处理的对照组相似的速度进入囊胚阶段。Ma等人对胚胎中23个潜在的脱靶编辑位点进行了测序，并对胚胎衍生的es细胞进行了全外显子组测序。他们还对选定的对照和CRISPR-Cas9注射胚胎进行了全基因组测序。在所有病例中，他们没有观察到可归因于CRISPR编辑的脱靶效应。

结论与意义

这篇论文的一个显著特征是胚胎无法使用所提供的ssODN模板进行编辑。事实上，这一发现让作者将论文命名为“纠正致病基因突变”。“而不是使用‘编辑’这个词。“虽然用内源性染色体DNA修复杂合突变很有吸引力，但显然对纯合突变更具挑战性。”此外，用目前的工具引入新的DNA似乎是不可能的，因此平息了一些对“设计婴儿”创造的担忧。

在编辑上的差异“诱导多能性”细胞胚胎为胚胎研究提供了一个案例，如果我们的社会决定生殖系编辑在预防疾病的情况下是允许的。然而，重要的是要考虑到已经测试过的CRISPR替代品在许多情况下是适用的。在肥厚性心肌病和其他遗传疾病的情况下，植入前遗传学诊断(PGD)筛选胚胎，以发现那些不携带给定的显性致病基因，或只携带一个隐性基因副本的胚胎。Ma等人声称，CRISPR仍然有助于增加可存活的胚胎，特别是在高龄母亲的情况下，对她们来说，提取卵子往往会导致卵子减少。然而，这种治疗的潜在惊人成本加上体外受精的费用，使得这种说法目前不太有说服力。

围绕基于crispr的治疗的另一个问题是需要确定是否会发生脱靶编辑或马赛克的测试水平。尽管Ma等人研究了各种预测的脱靶效应，但他们将整个基因组测序限制在一小部分编辑过的胚胎中。由于产生的胚胎没有被用于怀孕，研究人员能够检查每个卵裂球来确定其基因型。然而，这种详细的分析在试管受精中是不可能的，因为大多数细胞都是正常发育所需要的。Ma等人的实验显示，嵌合率为3%，在考虑临床应用之前，这个比率需要非常非常低。

重要的是要考虑CRISPR种系编辑的更广泛适用性问题。自然新闻提到MYBPC3研究中使用的gRNA几乎没有预测到脱靶效应，但这一优势可能不会转移到我们想要靶向的所有基因上。此外，由于gRNA与gRNA的靶上编辑率差异很大，因此尚不清楚本研究的编辑成功率会下降到什么程度。如果CRISPR将疾病无等位基因胚胎的比例提高到只有60%，那么它对特定疾病仍然有价值吗?不幸的是，考虑到胚胎CRISPR修复和iPS模型之间的差异，胚胎研究似乎是回答效率和适用性问题的唯一途径。考虑到围绕这类研究的道德和伦理问题，至关重要的是，科学家必须谨慎进行研究，并在由不同背景的个人组成的监管和伦理委员会的适当监督下进行。

和非生物学家朋友讨论这项研究

和我一样，你可能也看到过这个研究(以及各种文章和评论)推特和脸谱网，生物学家和非生物学家都有。鉴于这项研究的公开意义，我们有义务尽可能公开和准确地讨论它。我们必须注意到CRISPR并不是一颗“神奇的子弹”:它的使用总是伴随着一些不确定性。

既然生物学家有能力理解这篇论文的结果，我们应该愿意在看到它的时候纠正它。这篇论文代表了我们对CRISPR在胚胎中如何发挥作用的理解的巨大进步，但也表明，在我们考虑生殖系编辑的临床应用之前，还需要更多的实验。尽管这篇论文代表了CRISPR领域的一大步，但重要的是要记住，该研究没有实现任何PGD等现有技术无法实现的最终目标。

参考

马，洪等。"纠正人类胚胎致病基因突变"自然．Epub 02 August 2017。doi: 10.1038 / nature23305。PubMedPMID: 28783728．

Addgene博客上的额外资源188博金宝官网

• 看看我们的新产品CRISPR主题页面
• 读到高保真CRISPR变体
• 用CRISPR同时瞄准多个基因

在Addgene.org上的资源

• 浏览所有CRISPR质粒
• 看看我们CRISPR引导页