CRISPRainbow和基因组可视化

多彩的CRISPR技术正在帮助研究人员可视化基因组及其在细胞核中的组织，也被称为4D核心．可视化特定基因座在历史上难以困难，因为荧光等技术原位杂交（鱼类）和染色体捕获患有低分辨率，不能使用体内．一些研究人员已经使用荧光标记的dna结合蛋白来标记某些位点，但这种方法并不适用于每个位点……不像CRISPR。早期的CRISPR标记技术使研究人员能够可视化几乎任何单个基因组位点，而最近的进展使科学家能够使用所有的颜色随时间追踪多个基因组位点CRISPRainbow．

使用DCAS9可视化Genomic Loci In Vivo.

CRISPR的灵活性提高了我们几乎每个基因组基因座的能力，并这样做体内．催化死Cas9 (dCas9)不能诱导基因编辑，但保留了grna定向靶向的能力。通过使用gRNA将荧光标记的dCas9定位到给定的基因组位点，您可以跟踪该位点在活细胞中的定位和移动!这项技术是在Addgene depositor实验室开发的斯坦利齐和使用的陈等人。跟踪整个细胞周期的端粒动态。为了优化系统的信噪比，他们对GFP-dCas9和gRNA支架进行了修饰，以增强复合物组装，从而降低了未结合GFP-dCas9的背景荧光量。通过这些改进，标记效率与可比FISH方法相似。重要的是，当a.不存在gRNA或b.提供了与非哺乳动物序列(GAL4)结合的gRNA时，他们没有观察到标记。

除标记重复的端粒序列外，陈等人。用内肾内和外源GRNA成功标记蛋白质编码基因。实际上，该方法特异性和敏感性足以检测基于观察到的荧光斑块数量的基因拷贝数。通过同时标记给定染色体的两种基因，它们还可以在2-75 Mbp的距离范围内监测两个基因的空间关系。

标记多个染色体内位点

建立工作陈等人。那Thoru Pederson的实验室使用CRISPR以不同颜色标记多个基因座。创建一个彩色Cas9工具箱，马等人。转向SPCAS9及其orthologs NMCAS9和ST1CAS9。将每个Orthologolog融合到不同的荧光蛋白中以产生三种不同的颜色。这些orthologs的特异性是关键：因为每个正轨需要不同PAM序列，为一个dCas9设计的gRNA应该是特定于该直系亲属的，而不是与其他直系亲属的串扰。

马等人。使用针对端粒序列的GRNA测试其DCAS9变体，并显示出不同的荧光标记的DCAS9s被有效地指向适当的靶序列。它们成功地使用特异于染色体9和13上的序列的GRNA标记了两对不同的染色体。它们接下来将注意力转化为映射成对的血管统称锁上基因座。该技术成功地解析了具有2和75 MBP的物理贴图距离的基因座，其中计算出的荧光距离与先前建立的物理图相相关。在比较〜2 MBP的对成对的情况下，他们注意到它们即使对于这个小距离也可以评估染色质压实的程度！对于作者的知识，这项工作代表了第一次映射雄性统计学基因座，是表征4D核组的主要基准。

Crisprainkbow：缩放6种颜色+白色

尽管Ma等人的方法取得了成功，但荧光标记的Cas9具有许多限制。由于颜色由PAM序列指定，因此每种颜色需要不同的CAS9 Ortholog，并且目标序列必须位于该PAM附近。为了扩大荧光克隆克劳普尔标签，他们采取了一种新方法：标记GRNA本身。

在他们的crisprainbow纸上，马等人。工程gRNA支架包含两个发夹序列，其中招募荧光蛋白BFP, GFP和RFP融合到各自的发夹结合域。金宝搏app下载对相同的发夹序列指定原色蓝色、绿色和红色。相比之下，带有两个不同发夹的gRNA会产生青色、黄色或品红，这取决于发夹的组合，使单个颜色的总数达到6种。带有三个发夹的gRNA会产生白光。6种grna均可在单一载体中表达，pcrisprainbow-donor1， dCas9由单独的向量提供。

通过这种彩虹般的颜色，Ma等人对活细胞中的多个染色体位点进行了复杂的跟踪。然而，他们指出，某些改进可以让CRISPRainbow变得更好。添加额外的发夹/荧光蛋白组合，例如，与远红色的FP，将增加可用的颜色到15!他们还设想将CRISPRainbow与基因编辑结合使用。CRISPRainbow需要非常短的11-mer gRNAs不要诱导基因组编辑．如果与催化活性Cas9一起使用，短的CRISPRainbow gRNA将允许标记，但新表达的标准长度gRNA将“切换”系统，并诱导基因组编辑。这种系统以前曾被描述为转录激活/抑制和基因组编辑。

准备好让你的细胞更有色彩了吗?CRISPRainbow是可作为工具包使用从Addgene。

参考文献

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2. MA，Hanhui，等。“人体细胞中的染色体基因座的多色克切片标记。”Proc。natl。阿卡。SCI。美国112(10)(2015): 3002 - 7。PUBMED.PMID：25713381．pPMCID：PMC4364232．

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