CUT&RUN：研究蛋白质与DNA相互作用的一种改进方法

客座博主

部落客2018年2月13日

这篇文章由特邀博客作者Matthew J.Niederhuber撰稿，他是北卡罗来纳大学教堂山分校的研究生。

染色质免疫沉淀和高通量测序（ChIP-Seq）是一种定位蛋白质与全基因组结合的常用方法，已广泛应用于许多模式生物和细胞系。尽管ChIP-seq是一个相对简单且健壮的协议，但它确实存在局限性。基于酶的切割-运行方法克服了许多这些限制，并使您能够更容易地将蛋白质-DNA相互作用与有限的生物材料进行映射。

芯片seq的问题

ChIP seq通常需要大量的输入材料、细胞或组织，才能在背景噪声中产生足够强的信号. 在使用细胞培养时，这并不是什么大问题，因为它很容易获得大量细胞。然而，当对整个动物模型中的特定组织或器官进行研究时果蝇黑胃病因此，获得足够的材料进行芯片序列实验可能是一个主要的技术障碍。
ChIP seq在初始固定步骤中需要交联. 这有助于稳定DNA与蛋白质之间的相互作用，以便随后通过超声作用使DNA变薄。尽管它有助于捕获较弱或更短暂的DNA-蛋白质相互作用，但对固定的依赖确实增加了假阳性的机会，因为蛋白质可能在特定的基因组位点上结合，而事实上它们只是非特异性或间接相互作用。

割&跑法

进来切断并运行，一种基于酶的协议，用于识别DNA结合模式，克服了ChIP-seq的一些限制。CUT&RUN，代表“在靶点下切割并使用核酸酶释放”，最近由海尼科夫实验室在华盛顿大学。剪切和运行不需要固定，并显著降低背景噪音，减少测序时所需的读取深度，减少每次实验所需的组织数量。

在麦凯实验室我们研究了在发育过程中如何使用果蝇以机翼为模型。一个典型的ChIP-Seq实验需要大约1000只翅膀。收集这么多的组织需要一个星期的多人进行解剖。使用CUT&RUN，我们成功地减少了翅膀，这样一天就可以轻松地收集到足够的实验组织。

切割和运行示意图

CUT&RUN的工作原理是利用蛋白质a融合微球菌核酸酶（MNase）的DNA切割活性，专门分离与感兴趣的蛋白质结合的DNA。首先，使用涂有凝集素的磁珠分离组织或细胞培养的细胞核。然后将细胞核与针对感兴趣蛋白质的一级抗体一起孵育。然后添加蛋白A融合MNase，蛋白A结合免疫球蛋白G（IgG），从而将MNase靶向抗体结合蛋白（图1）。重要的是，由于蛋白A对小鼠IgG的亲和力较弱，因此在添加蛋白A MNase之前，在使用非兔一级抗体时，与兔二级抗体孵育是有帮助的。

一旦MNase定位到靶位点，核酸酶被短暂激活以消化靶蛋白周围的DNA。这种靶向消化是通过添加钙来控制的，这种钙是酶的核酸酶活性所必需的，并且从反应开始到现在都是螯合的。核酸酶反应在冰上进行，且仅在短时间内进行，因此精确控制切割量并减轻非靶点消化产生的噪音。MNase消化后，在37℃下短时间孵育，从细胞核中释放片段°这些短DNA片段可以被纯化，用于随后的文库制备和高通量测序。

改进切割&运行方法并在您自己的实验室中使用

最近，亨尼科夫实验室发表了一篇预印纸概述了对初始切割和运行方案的改进，最重要的是使用强力清洁剂渗透细胞，而不是依赖细胞核提取。他们报告说，这一变化大大改进和简化了原始技术，特别是在细胞或组织制备的初始步骤方面。

总之，CUT&RUN提供了芯片seq的一个很好的替代方案，特别是在收集大量单元在技术上具有挑战性或需要高信噪比的情况下。结合现有的芯片序列数据集，它还提供了一个极好的额外的DNA结合位点测量方法，其中有许多现成的数据集。基于我们实验室和其他人采用切割-运行方法取得的成功，这项技术很可能会很快与芯片一起成为标准方法。

非常感谢我们的客座博主Matthew J.Niederhuber。