生成ips的交付方法

诱导多能干细胞(iPSCs)领域已经存在了10年。在这段时间里，科学家们使用了几乎所有可用的方法来生成诱导多能干细胞。诱导多能干细胞的产生在概念上相对简单:异位表达干细胞重编程因子的混合物，等待细胞去分化。然而，这是困难的，特别是作为一个新程序员，决定使用哪种方法。本文简要概述了重新编程的方法，目的是帮助读者选择适合他们研究的策略。

寻找用于干细胞研究的质粒

表1:不同ips生成方法的关键特征．一个重要的注意事项:在这个表中，重编程效率分为低、中或高是基于冈萨雷斯等．没有列出百分比，因为许多变量(单元格类型，使用的标准等)会影响重编程率，这样的数字可能会误导人。

整合iPSC交付方法

总的来说，有效和可靠地整合病毒载体产生ip188完整比分直播s，但它们有几个安全问题。首先，它们需要使用表达致癌基因的潜在有害病毒颗粒，如Myc。188完整比分直播由于插入突变的风险，病毒载体也有最大的iPSC产生方法的基因组足迹。随机整合也会产生异质性的iPSC细胞系，这可能会使细胞系之间的比较复杂化。转基因的不完全沉默也是一个问题，分化后Myc或其他致癌基因的重新激活也与此有关肿瘤形成在ipsc来源和ipsc移植小鼠中。cret可删除或tet可诱导的慢病毒解决了其中一些问题，但总体整合病毒系统目前缺乏翻译使用所需的安全性。

188完整比分直播

• 逆转录病毒：一些最初的iPSCs是用Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)衍生的逆转录病毒产生的。逆转录病毒188完整比分直播载体（如PMX或PMSCV，感染除分电池），与其他递送方法相比，具有更高的产生IPSC的效率。逆转录病毒具有〜8kb的克隆能力，因此单个多排序载体或多个单基因载体可用于包装重编程因子。重新编程的重要里程碑是重编程转基因的沉默和相应内源性多能基因的上调。重新编程转188完整比分直播基因的逆转录病毒载体易于不完全沉默，这导致不完全重编程。另外，IPSC衍生细胞中的病毒转基因的次数表达或重新表达可以干扰它们的分化电位。最后，逆转录病毒易于插入诱变和随机集成在IPSC克隆之间产生变化。逆转录病毒不被认为是安全的临床应用。
• 慢病毒：慢病毒载体188完整比分直播感染除去和非凡的细胞，并且具有比其他逆转录病毒载体更大的克隆能力（8-10kb）。188完整比分直播这使得可以使用具有由一个启动子驱动的多次重编程因子的多排序盒。虽然与MMLV衍生的逆转录病毒相比，慢病毒具有类似的重编程速率，但在重新编程后，它并不是压抑。可以通过使用TET诱导型病毒来克服这一点，以允许对重编程因子的表达进行控制。查看帖子末尾的链接，以获取addgene可获得的TET型重新编程向量。另一个缺点是慢病毒载体在每个转导细胞中插入不同的遗传位置，因188完整比分直播此克隆之间存在不可避免的异质性。这可以使样品之间的比较复杂化，即转基因表达，因此重编程的程度可能受插入位置的影响。慢病毒插入还可以破坏肿瘤抑制基因和/或癌基因的表达，可能导致感染细胞中的癌症状表型的呈现。像逆转录病毒一样，慢病毒递送不被认为是安全的临床应用。
  • 可割取的
    • Cre-lox慢病毒载体188完整比分直播该方法与使用标准慢病毒载体相同，但Cre重组酶的瞬时表达允许loxP位点两侧插入的转基因基因的删除。虽然在切除部位只有一个小的loxP瘢痕，但这种方法仍然不被认为是安全的治疗应用。
      
      
    • piggyBac (PB)转座子:PB转座子是一种可移动的遗传元素，通过载体和染色体DNA之间的“剪切粘贴”机制进行转座。PB的克隆容量约为9 ~ 14 kb。该系统作为含有转座子的供体质粒和表达转座子酶的辅助质粒转染细胞。供体质粒含有PB转座酶识别的末端重复序列。经过重编程后，转基因可以通过重新表达转座酶来去除。利用PB产生iPSCs的一个挑战是，转座子插入位点可能发生基因组改变，因此需要进行序列验证。

非整合iPSC交付方法

188完整比分直播

• 腺病毒：运载体188完整比分直播感染分裂和非凡的细胞并具有〜8KB的包装能力。通过这种包装能力，可以作为单个多函因子或用四种不同的腺病毒来递送重编程因子，每种不同的腺病毒，每个腺病毒表达一个因素。这些载体不会整合到基因组中，而不是通过细胞分裂稀释而损失。这种方法的缺点是在生成IPSC时具有较低的效率水平，通常比逆转录病毒低几个数量级;然而，因为它们不太可能导致插入诱变，腺病毒载体被认为是表达治疗应用的重编程因子的更安全的方法。188完整比分直播
• 仙台病毒载体188完整比分直播:仙台病毒是一种单链负意义RNA病毒。它是副黏液病毒科病毒家族，其中还包括麻疹和腮腺炎．仙台转导广泛的细胞类型和复制细胞质独立于细胞周期。使用仙台病毒的一个挑战是，由于它具有复制能力，即使经过多次传代，也很难将病毒从所有细胞中清除。禁令等开发了一种温度敏感的仙台病毒，可在38℃培养细胞去除，但筛选细胞是否存在转基因仍然是一个重要的控制。此外，仙台病毒不依赖启动子进行转录调控，因此需要一种不同的方法来调控转基因表达。看看佐野等人要了解MicroRNA如何用于调节仙台病毒转基因表达。

瞬态游离交付

非整合方法比整合方法具有更小的遗传足迹。这些方法消除了插入突变、基因瘢痕存在和转基因不完全沉默的风险。总的来说，非整合方法比整合方法更安全，RNA和蛋白质传递被认为是最安全的，因为重编程因子的残留表达风险最小。

• Non-replicating
  
  • 质粒:产生基于质粒表达的ips需要连续转染1或2个表达感兴趣的重编程因子的质粒。这种方法的优点是实现起来相对简单，而且不需要耗费大量时间来生产病毒。理论上，这是一种非积分方法;然而，在实践中可能会发生集成。Okita等描述了一种通过质粒转染产生诱导多能干细胞的方案，其中11个克隆中有2个有质粒整合。另一个挑战是多重转染使细胞在整个重编程期间很难控制质粒的剂量，而且质粒在细胞积极分裂时稀释得更快。使用转染的典型缺点仍然存在:转染效率依赖于细胞类型，质粒越大转染率越低。
    
    
  • 小型:迷你圆就像迷你质粒。它们只包含一个真核启动子和要表达的cDNA(s)，不整合或复制。它们的小体积导致更高的转染效率，由于dna沉默机制的激活较低，它们倾向于比传统质粒表达更长的时间。虽然微循环通常比传统的质粒小，贾等人通过~14.5kb的微圆表达a二肽由OCT4、SOX2、LIN28、NANOG和GFP报告器组成的多顺反盒式磁带。通过每次细胞分裂稀释，可以去除细胞中的小圆，但仍然需要几次传代才能完全去除小圆。
• 复制
  
  • 基于oriP/Epstein-Barr核抗原-1 (EBNA1)的发作体:这些质粒携带来自eb病毒的复制起源(oriP)元件和顺式作用EBNA-1。EBNA-1结合oriP，允许质粒在哺乳动物细胞中复制，并协助将载体连接到细胞染色体上。随着可选择标记的添加，该系统允许oriP/EBNA1质粒作为一个稳定的染色体外DNA片段。与其他方法相比，重编程效率较低。这可能是质粒体积大或质粒因DNA甲基化而沉默的反映。使用以EBNA1为基础的载体的另一个缺点是，即使在选择被移除之后，质粒也可能停留一段时间。于等发现，来自EBNA1 IPSCS产生的亚克酮仍然存在剧集DNA。

DNA-Free方法

• RNA交付：对于这种方法，体外转录的rna使用阳离子载体连续转染。以下合成修饰被用来保护rna不受细胞对ssRNA的防御:磷酸酶处理，用5-甲基胞苷取代胞苷，和/或用伪尿苷取代尿苷。使用RNA对细胞进行重组的主要优点是简单高效。与其他方法相比，它具有很高的重编程效率，甚至与整合病毒方法相比。它的安全性也很高。

• 蛋白质交付:以蛋白质形式传递重编程因子是避免细胞暴露于外源遗传物质的另一种方法。蛋白质通过与多肽融合来传递到细胞，多肽有助于调节它们的转导，如多精氨酸多肽周等和金等．这被认为是开发治疗应用的一种更安全的方法，但它可能需要很长时间来重新编程细胞。Kim等人将细胞暴露于重编程蛋白中，每周8小时，持续6周，仍然需要进一步培养以产生iPSC菌落。重编程的效率也很低，而且很难纯化进行这些实验所需的重编程蛋白质。

ips特性分析

一旦产生了iPSC克隆，确定干细胞的行为就很重要了。ips细胞通常首先用分子检测法进行检测。这些方法不那么严格地评估多能性，但它们完成的时间也更少。形态学是一种简单、快速的评价方法。诱导多能干细胞应形成紧凑的菌落，由细胞核大、核仁大、细胞质少的细胞组成。碱性磷酸酶的阳性染色、胚胎蛋白的表达、启动子去甲基化和内源性多能性基因(即Oct4)的表达是重编程的其他方法。如果使用了逆转录病毒，那么沉默这个载体是成功重编程的另一个标志。

如果细胞含有重编程的分子特征，那么它们通常会通过更严格的功能测试进行评估。细胞可以分化体外形成胚状体，它是由松散组织组成的致密球，表达所有三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的标记。测量小鼠细胞的多能性通常涉及到通过将诱导多能干细胞注射到囊胚中并将其植入雌性小鼠来制造嵌合体。嵌合后代的产生表明iPSC能够促进所有三个胚层的发育，这些嵌合体产生全iPSC衍生后代的能力表明iPSC能够形成功能性生殖细胞。对小鼠诱导多能干细胞最严格的测试是四倍体互补，包括向四倍体胚泡注射诱导多能干细胞并测量它们指导小鼠发育的能力。

由于人类ips细胞无法进行这些功能测试，因此产生畸胎瘤的能力是黄金标准。畸胎瘤的形成需要将诱导多能干细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，并寻找含有所有三个胚层细胞的肿瘤。

选择一种重新编程的方法

大多数iPSC研究分为两类:1)专注于更好地理解重编程机制的研究，2)具有临床终点的研究。在第一种情况下，强大和高效地产生ips scs是第一优先事项，而安全优先级较低。基因组整合不是一个大问题，所以病毒载体更适合这些情况。188完整比分直播第二种方案要求更高的安全性和尽可能少的基因组改变机会，以效率为代价。非整合方法，如偶合体、RNA传递和蛋白质传递更适合这些类型的研究。什么细胞被重新编程也会影响结果，因为并不是所有的细胞类型都是容易获得或容易被重新编程的。基本上，没有通用的方法可以处理ips细胞的所有应用，但至少应该有一种方法可以帮助你实现你的研究目标。

你是新来的还是有经验的程序员?你有使用哪些方法的经验?请在下面的评论中告诉我们你的ipsc体验!

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