在你拿起硅胶旋转柱之前，停下来想想在没有工具的情况下净化DNA的方法。DNA纯化试剂盒的优点是:它们方便，并提供统一、一致的结果。但由于他们的费用和对实验室设备的需求，他们也不太容易接近。此外，它们还会产生塑料垃圾。工具包还可能有一种恼人的倾向，即在您需要它们的时候就用完了，并且由于您已经用完列而积累了一堆未使用的缓冲区。
无试剂盒的DNA纯化方法避免了试剂盒的许多缺点，通常遵循相同的原则:细胞被裂解，rna和蛋白质被移除，留给你DNA。然后这些DNA被清洗，或者从固定的表面被洗掉，或者沉淀、干燥，然后再水合。根据纯化的DNA类型(质粒、基因组或琼脂糖中的DNA片段)，会有一些细微的修改。
在本文中，我们将介绍四种无试剂盒的DNA纯化方法的基础知识，以及一种从DNA纯化试剂盒中重复使用硅胶柱的方法。
无包碱性裂解质粒迷你prep
原料:2 mL细菌培养
产品:质粒DNA
这来自Addgene的无试剂盒质粒miniprep方案与基于柱的质粒提取试剂盒遵循类似的工作流程。首先，在溶液中溶解细菌并使DNA和蛋白质变性。然后使用再生溶液降低pH值，导致蛋白质和基因组DNA沉淀。质粒DNA在溶液中是游离的。蛋白质和基因组DNA被离心除去。在这一点上，质粒DNA样本可以用RNase处理以去除RNA污染，你可以使用酚氯仿提取来去除剩余的蛋白质和RNase。最后，用酒精沉淀DNA并在TE缓冲液中重悬。之后，DNA就可以使用了!
用玻璃注射器过滤器纯化质粒和提取DNA凝胶
原料:细菌培养或琼脂糖凝胶切片
产品:质粒或DNA片段
本发明所述的质粒纯化和DNA凝胶提取方法金姆和莫里森几乎和市面上的试剂盒一样，但它不是将DNA与硅胶柱结合，而是与玻璃注射器过滤器. 通常情况下，DNA不结合二氧化硅或玻璃，而是添加高浓度的超嗜盐（质粒纯化方案为盐酸胍，质粒纯化方案为异硫氰酸胍）凝胶萃取协议)破坏了DNA与水分子的氢键，并诱导它粘附在疏水玻璃过滤器上。每个玻璃过滤器可以捕获多达150微克的DNA，过滤器可以串联堆叠在一起，以增加结合能力。
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| 图1:使用玻璃过滤器净化DNA。图片:金和莫里森，2009年． |
这种方法提供了与商业试剂盒相似的DNA产量和质量，但时间更短。作者估计，基于重力的柱状质粒maxiprep试剂盒需要1-1.5小时完成，而这种基于注射器的方法可以在20 - 30分钟内完成。此外,虽然商业质粒准备包有谨慎的大小(迷你,midi,马克西,gb),需要你购买不同的包不同的目的,与金正日和莫里森方法,你可以调整玻璃过滤器使用的数量根据细菌培养您正在使用的大小。总的来说，玻璃注射器过滤法不仅便宜，而且比商业套件更快、更灵活。
用玻璃牛奶提取DNA凝胶
原料:琼脂糖凝胶片
产品:DNA片段
你可能会想:“牛奶怎么能帮我从琼脂糖凝胶中提取DNA ?!”
用玻璃乳法进行DNA凝胶提取从芝加哥大学的Bishop实验室并不是用真正的牛奶来净化DNA，而是用一种外观像牛奶的玻璃粉浆。为了使DNA粘附在玻璃牛奶中的玻璃颗粒上，凝胶切片首先被放置在一种朝性盐钠碘(NaI)溶液中。在这个方案中，NaI有两个目的:1)它溶解DNA和琼脂糖，2)它帮助DNA粘附在玻璃上。结合DNA后，通过离心将玻璃颗粒成球，然后用水或TE洗脱DNA。
主教实验室的玻璃牛奶协议是根据1979年帕特森协议．当发表的时候，帕特森方案被证明可以纯化大小从100 bp到48 kb的DNA，而且在提取过程中没有降解，而且产量高。纯化后的DNA不含琼脂糖，可被限制性内切酶消化。
纤维素核酸纯化
原料:植物、微生物、血液或哺乳动物细胞或组织
产品:总核酸
玻璃或二氧化硅通常用于结合和纯化DNA，纤维素也能有效结合，或至少能捕获核酸。博特拉实验室利用了这一特性制定了一个协议该公司使用Whatman No. 1号纸，甚至是纸巾，在不使用吸管的情况下，在30秒或更短的时间内，从植物、微生物、血液或哺乳动物细胞中净化DNA和RNA。
这种方法是这样工作的:用盐、洗涤剂和滚珠轴承溶液将核酸从细胞中分离出来。然后用纤维素试纸蘸着这种混合物来吸收核酸。内含物与纤维素的结合不像核酸那么紧密，所以将试纸放入洗涤液中可以去除污染物，而核酸则会留在溶液中。最后，将纯化的总核酸直接浸入PCR缓冲液中，可以扩增DNA或RNA。与基于磁珠的商用试剂盒相比，这种基于纤维素的方法更快、更便宜，而且具有类似水平的灵敏度。
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| 图2:使用纤维素试纸纯化DNA的步骤。图片:邹等人，2018． |
DNA纯化用二氧化硅柱的再生
原料:PCR产物或琼脂糖凝胶切片
产品:纯化的PCR产物或DNA片段
也许你还没准备好放弃DNA纯化工具，但你想减少实验室的浪费足迹。赵和邓的实验室开发了一种简单的硅柱再生方法带有PCR产品纯化或DNA凝胶提取试剂盒。这种方法不需要30分钟，只需要用1M磷酸孵育柱3分钟，然后短时间离心，共4次，然后用ddH2O和乙醇洗涤。再生后，微量DNA(3飞图克/ul)仍可从柱中洗脱，通过qPCR检测，但这并不降低克隆效率。
与新鲜色谱柱相比，再生色谱柱的DNA产量相似。此外，再生5次的色谱柱与新鲜色谱柱的DNA产量相似，这表明色谱柱至少可以重复使用5次。DNA纯化试剂盒没有足够的缓冲液用于这么多的色谱柱，但赵和邓的实验室发现，当试剂盒缓冲液用完时，他们可以自己制作缓冲液。自制缓冲器的效果与套件中提供的相同。虽然作者没有进行测试，但有可能使用的质粒纯化柱也可以用1M磷酸清洗并重复使用，但微量污染可能会干扰对转染检测结果的解释。
在没有工具的情况下进行DNA提取吧!
不管你想净化的是哪种类型的DNA，也不管你是否有不使用套件的动机，这里都有一个适合你的方法!即使你还没有准备好用你的DNA纯化试剂盒分解，你仍然可以减少完成你的研究所需的自旋柱的数量。你知道今天帖子中没有提到的其他核酸净化方法吗?请在评论中告诉我们!
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Kim, Y.， & Morrison, S.L.(2009)。一种快速和经济的使用玻璃注射器过滤器的内部DNA纯化方法。《公共科学图书馆•综合》．https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007750
Vogelstein, B.， & Gillespie, d .(1979)。琼脂糖DNA的制备及分析纯化。《美国国家科学院院刊》，76, 615-9 .https://doi.org/10.1073/pnas.76.2.615
周,Y。,,Y。,他,W, Wang J。,彭,F。,黄,L,赵,年代,&邓W(2018)。PCR纯化和凝胶提取试剂盒二氧化硅柱的快速再生和再利用。科学报告．https://doi.org/10.1038/s41598-018-30316-w
邹勇，梅森，M.G，王勇，魏e.j, Turni, C.， Blackall, P.J.， Trau, M.， & Botella, J.R.(2017)。30秒内从植物，动物和微生物中提取核酸。公共科学图书馆生物学．https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2003916
主题:分子生物学协议和提示，质粒
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