液滴数字PCR用于AAV定量

自从Addgene开始生产AAV载体制备以来，我们使用了定量PCR来评估我们的制备物的物理效价。我们经常重复这个实验以确认我们的结果是准确的。但如果我们能重复这个实验一万次以确保滴度尽可能准确呢?这就是滴滴数字PCR (ddPCR)发挥作用的地方。

AAV滴度使用定量PCR

在我们深入ddPCR的细节之前，我们应该首先注意到定量PCR (qPCR)已经成为一段时间定量AAV的强大工具。当qPCR滴定AAV，病毒DNA被放大并实时监测。当PCR完成时，通过比较病毒DNA的阈值荧光值和标准的阈值荧光值(一组已知DNA数量的反应)来分析结果。此外，一个AAV参考，一个已知滴度的病毒，可以用来确认标准曲线给出了样品的准确读数．

当然，如果qPCR是完美的，ddPCR就没有必要了。qPCR的一个问题是，结果可能相差2倍。这意味着如果你用相同的样本建立两个相同的检测，你可能会得到4 × 10的滴度¹²基因组拷贝/mL或8 × 10¹²两个结果都是有效的。这就是为什么AAV参考是至关重要的。它允许您确定您的滴度是否在预期范围内。

我们还发现，qPCR标准曲线的生成具有挑战性。在Addgene，我们使用线性化的质粒标准。然而，即使制定了合适的标准，它也不稳定，可能只适用于少量的qPCR运行，然后才需要新的qPCR。由于这些原因，我们正在将我们的滴度方法从qPCR过渡到ddPCR。

滴滴数字PCR (ddPCR)不需要标准或参考，这意味着节省试剂(和时间)!

滴式数字PCR测定AAV滴度

液滴数字PCR是利用水-油乳状液技术将PCR反应混合物分割成大约20,000个液滴。每一滴都含有目标DNA扩增的成分。这种分配减少了每个反应的PCR抑制剂的数量，并允许加强对产品的检测。作为一个附加的好处，复制被内置到该技术中。一个井(包含数千滴)足以捕获聚合酶链反应实验所需的信息。

用ddPCR滴定AAV的过程从稀释病毒开始。值得注意的是，ddPCR的动态范围在每个反应1到100,000个基因组拷贝(GC)之间。因为AAV滴度往往在10¹²到10¹³GC/mL，你必须连续稀释你的病毒，然后将你的样品加入母混。在Addgene，我们通常在ddPCR板上加载3种稀释剂。由于滴度是未知的，每次稀释都应该在一个大范围滴度的测定范围内。我们通常将样品稀释到1:6 0万到1:25万。

稀释后，将它们转移到含有母料的新板上，母料包括引物和ddPCR超混合。注意，你使用的混合油和滴油应该来自同一家制造商。否则，你最终会得到较差的水滴质量。

使用液滴发生器，样品和液滴生成的油通过小通道移动，形成一种含有大约20,000个液滴的油包水乳状液。每个液滴都含有发生微小放大反应所需的物质。

PCR完成后，液滴阅读器从平板上提取液滴并测量每个液滴的荧光振幅。荧光液滴含有扩增的目标序列。读取所有液滴后，软件输出每个孔中每个液滴测量到的荧光振幅图像(图2)。干净的ddPCR应该在阳性(蓝色)和阴性(灰色)液滴之间有清晰的分离。无模板控制井的正液滴应该非常少。在右侧的图像中，在无模板控制的井中，每微升大约有1个阳性拷贝。你还会注意到正液滴的数量随着稀释量的增加而减少。

ddPCR软件利用正滴与负滴的比值来计算样品的浓度。这个浓度可以用来计算病毒滴度:

GC /毫升= {((R * C) (1000 / V)] * D}

反应体积

C =副本/ uL

V =反应混合中病毒的体积

D =病毒稀释系数

大多数液滴阅读器有几个检测荧光的通道，因此可以同时测量多个目标的浓度。对于AAV滴定，你应该只需要使用一个。但是，可以使用两个通道检查病毒基因组的完整性(Furuta-Hanawa等人，2019)。

ddPCR的技巧和技巧

干净的一切

你必须有一个干净的工作区域，用ddPCR滴定你的AAV。液滴数字PCR是一种敏感的检测方法，因此交叉污染到无模板控制(NTC)井是常见的。以下是一些你可以采取的步骤来实现一个干净的NTC:

• 有一个专门的工作台和一套专门的移液器用于ddPCR的设置。
• 在一个单独的区域准备主混合，从你准备你的样品稀释。
• 将你所有的试剂放入一次性使用的试管中，并为每个设置取一个新的。
• 用10%的漂白剂擦拭工作台和所有消耗品。

吸管慢慢

如果您使用手动液滴发生器，则必须小心将液滴从液滴发生器转移到PCR板。保持高滴数对计算样品浓度很重要。

即使你在使用自动液滴发生器，你也应该避免在稀释病毒时移液过快。这将减少可能导致污染的气溶胶。

优化你的聚合酶链反应

关于使用何种PCR参数，请参阅洛克关于AAV滴定的开创性论文(Lock等人，2014)。

如果你在使用这些参数时很难在正液滴和负液滴之间获得清晰的分离，你可以尝试以下几件事情:

• 增加循环次数。在额外的放大轮后，你的荧光振幅将增加，导致你的正和负液滴更大的分离。建议不超过50个周期。
• 降低斜坡速度。建议速率为2C/s，以确保所有液滴之间的温度变化均匀，但也可以低至1C/s。
• 延长时间为2分钟，变性时间为1分钟增加液滴分离(Witte et al.， 2016)。如果扩增子的长度超过150个碱基对，这一点尤其重要。

当我们将ddPCR用于AAV滴定时，该技术有许多应用。液滴数字PCR适用于低拷贝数的检测。因此，它可以用于稀有序列的检测和单细胞分析。它也被用于微生物检测。一些应用程序包括测量可行的益生菌和检测病原体的传播．

液滴数字PCR由于其广泛的应用和易用性，正成为PCR实验的热门选择。

参考文献

古田花awa，比雷，山口照英，内田惠子。二维液滴数字PCR作为重组腺相关病毒载体的滴定和完整性评估的工具。188完整比分直播人类基因治疗晶澳(2019)。PubMedPMID: 31140327．公共医学中心PMCID: PMC6707039．

戈贝尔，纪尧姆等。“液滴数字PCR提高了粪便样本中活乳酸菌的绝对定量。”微生物方法杂志148(2018): 64 - 73。PubMedPMID: 29548643．

洛克，马丁等人。“用液滴数字PCR绝对测定单链和自互补腺相关病毒载体基因组滴度。”人类基因治疗方法25.2(2013):115-125。PubMedPMID: 24328707．公共医学中心PMCID: PMC3991984．

宋能，等。“用液滴数字PCR检测循环结核分枝杆菌特异性DNA用于感染猴子的疫苗评价和结核病诊断。”新兴微生物与感染7.1(2018):1-9。PubMedPMID: 29691363．公共医学中心PMCID: PMC5915492．

Witte, Anna Kristina等。“对单核增生李斯特菌prfA测定中影响液滴雨参数的系统研究——减少ddPCR中不明确的结果。”《公共科学图书馆•综合》11.12 (2016): e0168179。PubMedPMID: 27992475．公共医学中心PMCID: PMC5167268．

Addgene博客上的其他资源188博金宝官网

• 阅读更多关于聚合酶链反应
• 浏览我们相关的博客帖子病毒载体协议和提示
• 阅读我们所有的188完整比分直播病毒载体博客文章

在Addgene.org上的资源

• 学习我们的采用qPCR方法测定AAV
• 浏览我们收藏的病毒载体相关协议
• 了解更多有关Addgene病毒服务