easycrispr:生成敲入和条件小鼠模型

CRISPR基因组编辑使在包括标准实验室小鼠在内的各种物种中创建敲除等位基因变得更容易。这也是让定向插入相对简单秀丽隐杆线虫和细菌．但是CRISPRing典型的鼠标模型，包括创造Cre-dependent条件等位基因，仍然是一个挑战。输入Easicrispr:一种利用ssDNA供体分子力量的方法同源性定向修复．通过使用长ssDNA供体，Gurumurthy和Ohtsuka小组获得了平均30-60%的启动效率。这比以前的方法更有利，可以产生1-10%的效应。继续读下去，学习如何生成CRISPR小鼠模型easi -呃!

在CRISPR之前产生小鼠

的过程生成敲入小鼠pre-CRISPR是非常困难的。首先，你要构建一个带有你想要的改变，长同源臂和选择标记的质粒，然后电穿孔到小鼠胚胎干细胞中。在用重组产物选择克隆后，你将微注射到胚泡中，然后植入假怀孕的雌性老鼠体内。如果你得到了想要的嵌合小鼠，你会多次繁殖它们，希望产生一个具有想要的编辑的小鼠。您还需要删除选择标记，可能是繁殖到一个老鼠系重组酶．如果结果证明你的嵌合小鼠不包含编辑过的生殖细胞，你的实验将会失败。

CRISPR使小鼠模型生成的整个过程变得更简单，正如之前的一篇文章所描述的那样生成CRISPR小鼠模型．对于简单的敲除等位基因或点突变，传统的基因靶向过程从8-10个月降低到2-3个月左右。但某些型号的制造仍然比较困难。例如，大的插入，如荧光蛋白当使用标准的dsDNA修复模板时，其效率较低。创造条件等位基因的最初设计，或称“卷曲老鼠”，来自杨et al。为了插入两个loxP位点，需要两个针对两个内含子区域和两个修复模板的grna。由于发生了两次双链断裂，grna之间区域的缺失是很常见的。还有很多其他不希望的结果，包括一个loxP站点插入和一个NHEJ-repaired indel,经常发生。

单链DNA修复模板

短单链DNA模板已经被证明可以提高效率同源性定向修复研究人员假设它们可以通过HDR子途径有效地整合到DNA中。传统上很难制造长单链DNA，但是三浦等。(2015）开发了4采用TRT方法来改善这一问题。简单地说，你设计你的供体模板，包括左同源臂上游的T7启动子，进行体外转录，并使用IVT产品作为反转录模板来创建你的ssDNA。注意，T7启动子将不包含在最终的ssDNA模板中。

尽管有效,4对于二级结构复杂的序列，TRT可能更具挑战性。如今，许多公司提供长单链DNA生产服务或试剂盒，包括IDT Megamer服务测试Quadros等．

当传递ssDNA模板和CRISPR机制时，Quadros等人推荐核糖核蛋白(RNP)复合物Cas9蛋白和分离的引导RNA组分(crRNA和tracrRNA)Easi -CRISPR效率。Easicrispr与用于小鼠转基因的标准微注射和电穿孔方法兼容。

设计一个Easi-CRISPR敲入等位基因

要在给定的位置设计一个敲入的等位基因，你只需要设计一个单一的指南和供体的ssDNA。在这里，我们将使用插入2A-FlpO盒式磁带的例子Fgf8基因。Miura等人(2018)建议在目标插入位点周围使用50-80 bp的序列来寻找潜在的grna。与其他同源性导向修复实验一样，你会希望引导切割部位尽可能接近你想要的插入部位，以最大限度地提高HDR效率。在这种情况下，我们很幸运，在终止密码子之前有一个引导乳沟的向导!

设计您的修复模板与55-100碱基同源臂上游和下游的插入位点。如果你正在使用4TRT法，尽量使前两个碱基的左同源臂鸟嘌呤(即GG);这种设计已经被证明可以增加T7启动子的活性。为避免编辑后Cas9重新切割，请确保修复模板中不包含野生型gRNA靶位点和邻近PAM。你的敲入设计可能会自然地移除gRNA序列或将其放置在远离PAM的地方;如果没有，可以添加静默PAM或引导突变。

设计一个Easi-CRISPR条件等位基因

设计一个弯曲的条件等位基因需要将2个loxP位点定位到相隔0.5 - 0.8 kb的内含子区域。在下面的例子中，我们将为的第6外显子的条件删除添加loxP位点Syt1它模仿了之前制作的老鼠模型。为了避免破坏剪接供体/受体位点，Miura等人(2018)推荐靶向位点，距离目标外显子至少100 bp。他们已经成功地使用导向相同或互补链的导向，以及朝向或远离彼此的导向。

就像在敲入的例子中一样，你要设计你的修复模板，每一边都有55-100 bp的同源性。为了获得最佳修复，将loxP位置精确地放置在每个导轨的切割位置。该设计还将gRNA的靶序列从其PAMs中分离出来，防止编辑后的重新剪切。

如何使用Addgene质粒Easi-CRISPR

你可以使用Addgene质粒来创建一个修复模板!如果你有一个带有你想要的插入特征的质粒(例如，荧光蛋白)，你可以使用两端包含同源臂和一端包含T7启动子的引物来扩增你想要的区域。通常情况下,Easi-CRISPR在2kb或更少的插入时工作得最好。幸运的是，大多数常用的磁带，如荧光蛋白(EGFP, mCherry等)，重组酶(Cre, Flp等)和四环素金宝搏app下载药物诱导系统(ttA或rtTA)的长度在1到2 kb之间。有很多Addgene质粒的模板选项-参见正确使用的例子蓝色的火焰质粒pmScarlet_C1！创建T7-DNA模板后，你会使用4如图2所示，TRT创建ssDNA结构。

也可以使用Addgene质粒纯化Cas9蛋白。下表包含了一些我们最喜欢的，所有的都有蓝色的火焰．

Easi-CRISPR效率和交付方式

采用RNP给药和微量注射，提高了效率Easi -简单敲入和弯曲模型的CRISPR在8.5-100%的幼犬出生中变化，典型效率为30-60%。Quadros等人将这种差异归因于引导RNA效率的差异。例如，在双导丝弯曲实验中，如果一个导丝的切割效率低于另一个，则可以观察到部分插入。靶位点的染色质结构也可能影响效率。然而，Quadros等人看到了成功Easi-CRISPR横跨三个独立的核心设施，为13个项目，大多数项目只需要40-60个受精卵就可以生成正确编辑的创始人。

研究小组负责Easicrispr最近也有了发展我- - - - - -作为一种简单的方法，将基因组编辑组件传递到种系。与标准的微量注射相比，我-通过一个小切口直接在怀孕的雌性老鼠身上进行性腺活动，暴露卵巢和输卵管。将溶液注入输卵管管腔后，放置镊子式电极介导电穿孔。

Ohtsuka et al。比较了传统的微注射和我使用小型ssDNA的-GONAD敲入效率，他们发现了类似的效率(52 vs 49%)。相比之下,Easi长ssDNA供体crispr的使用效率较低我-性腺激素(15%)vs.微量注射(25-67%)。然而，显微注射需要的动物数量是我-性腺功能障碍，这是一个技术上更困难的过程。总的来说，主要缺点是我- - - - - -性腺功能亢进需要高浓度的，柱纯化的DNA模板。

非常感谢chanabasavaiah B. Gurumurthy、Masato Ohtsuka和Rolen M. Quadros帮助编辑这篇博客文章。

参考文献

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Miura, Hiromi等。“通过使用较长的单链DNA插入人工microRNA的内含子，以CRISPR/ cas9为基础的敲除小鼠。”Sci代表．5(2015): 12799。DOI:10.1038 / srep12799PubMedPMID: 26242611公共医学中心PMCID: PMC4525291

Quadros, Rolen M.， et al. " easycrispr:一种使用长ssDNA供体和CRISPR核糖核蛋白一步产生带有条件和插入等位基因的小鼠的健壮方法。"基因组医学杂志。18(2017)(1): 92。DOI:10.1186 / s13059 - 017 - 1220 - 4PubMed PMID: 28511701公共医学中心PMCID: PMC5434640

三浦，广美，罗伦M. Quadros, chanabasavaiah B Gurumurthy和Masato Ohtsuka。“使用长ssDNA供体创建敲入和条件敲除小鼠模型的easycrispr。”Nat Protoc。13(2018)(1): 195 - 215。DOI:10.1038 / nprot.2017.153PubMedPMID: 29266098

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Addgene博客上的额外资源188博金宝官网

• 请阅读我们之前的帖子CRISPR小鼠模型
• 了解同源性定向修复
• 了解Cas9核糖核蛋白(RNP)递送

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