蛋白质纯化可能是最紧张的实验室活动之一。与蛋白质打交道需要大量的适当折叠的，相对纯净的蛋白质，但要达到这一阶段往往是说起来容易做起来难。正如我们在质粒101系列，蛋白质从质粒结构过表达，通常在特殊情况下大肠杆菌为蛋白表达而设计的菌株。然后对培养物进行裂解，并使用一种酶纯化所需的蛋白质亲和标签．附加标签可以用来提高蛋白质的稳定性和溶解性。
确定表达感兴趣蛋白质的最佳方式可以节省大量时间。蛋白质纯化专家建议做一些研究，特别是确定亚细胞定位和蛋白质中二硫键的数量——这两个参数会影响效果大肠杆菌可以产生蛋白质。许多蛋白质的结构信息很容易在蛋白质数据库和PDBsum．在获得这些信息之后，您可以选择一个表达向量和表达系统。如果你发现你的蛋白质可能不能很好地折叠，你应该筛选几种不同的载体，看看哪一种能提供最有功能的蛋白质。
pCri系统，最近由f·泽维尔Gomis-RutH，目的是通过简单高效的多路复用，将蛋白质纯化过程中的猜测去掉。pCri质粒分为两套，每一套都包含有不同种类的标签，包括N端和c端。每一组质粒都使用相同的限制性内切酶进行克隆(见下图)，使研究人员能够快速、轻松地测试一个蛋白质的多个标签。这些标记质粒还包括裂解位点，如果需要在纯化后去除标记。
pcr构建的样本:pcr -1a， -4a和-9a。他的标签使用Ni-NTA树脂进行亲和纯化。MBP改善了蛋白质的溶解性和稳定性。TRX和信号肽标签有助于具有二硫键的蛋白质正确折叠。如果存在TEV蛋白酶位点，TEV可以从纯化的蛋白上去除这些标签。有关这些和其他在pCri系统中使用的标签的更多详细信息，请参阅质粒101：蛋白质标签．
除了大肠杆菌：净化的枯草芽孢杆菌和毕赤酵母属pastoris
pcr还包括为蛋白质表达而设计的质粒大肠杆菌，特别是细菌枯草芽孢杆菌和酵母毕赤酵母。这些微生物分泌能力的提高使它们有助于产生难以折叠的蛋白质。此外p . pastoris是否有能力使蛋白质糖化，并可能重现翻译后修饰添加到其他真核生物的蛋白质更好大肠杆菌．为这些系统设计的质粒可能包括一个信号肽(SP)，它通过分泌途径引导蛋白质，以改善折叠和二硫键的形成。如果一个人更喜欢表达大肠杆菌，硫氧还蛋白a (TRX)载体的使用可以促进二硫键的形成。
pCri还包括一个难以纯化的膜蛋白的特殊功能。pCri向量pCri-13a，设计用于枯草杆菌，包含了(翻译完整膜蛋白结构的膜整合序列)蛋白标签。MISTIC将标记蛋白拖入膜中，可能会改善原定位于膜中的蛋白的表达。
pCri既通用又易于使用，我们希望它能减轻蛋白质纯化的压力。有关pCri更全面的介绍，请参阅以下引用的原始出版物。pCri质粒也可用个别地或作为一个complete kit from Addgene．工具书类
1.Goulas, Theodoros等。pcr系统:用于重组蛋白表达和纯化的载体集合。《公共科学图书馆•综合》9.11 (2014): e112643. PubMedPMID: 25386923. PubMedCentralPMCID: PMC4227841．
2.杨、卡丽莎·L、扎卡里·T·布里顿和安妮·S·罗宾逊。“重组蛋白表达和纯化：亲和标签和微生物应用的综合评述。”生物技术杂志7.5(2012): 620 - 634。PubMedPMID: 22442034．
额外的资源
参考资料在Addgene博客188博金宝官网- 发现附加克隆工具包
留下你的评论